히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리
2011년 9월 29일
우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.
이 비디오는 핵산 조성에 따라 혼합된 바이러스 집합체를 분리하는 절차를 보여줍니다. 이를 통해 복잡한 바이러스 집합체의 분류학적 다양성과 기능적 잠재력을 연구할 수 있습니다. 여기서 인산 칼슘의 결정 형태 인 하이드 록시아 인회석이 핵산 분리에 사용됩니다.
먼저, 하이드록시아파타이트 컬럼을 패킹하고 평형화한 정제된 바이러스 핵산을 컬럼에 적용하고, 하이드록시아파타이트의 양전하를 띤 칼슘 이온과 핵산 아형의 음전하를 띤 인산염 골격 사이의 전하 상호 작용은 핵산을 컬럼 Nick에 결합합니다. 다음으로 단일 가닥, D-N-A-R-N-A 및 이중 가닥 DNA는 서로 다른 농도의 인산염 완충액으로 순차적으로 암시됩니다. 생성된 핵산은 그런 다음 DNA 염기서열분석 agros gel 전기영동에 의한 시각화, 정량화 및 식별을 준비하기 위해 탈염 및 농축되어 핵산 종을 9% 미만의 캐리오버로 분리할 수 있음을 확인합니다.
따라서 이 방법을 사용하면 바이러스 군집의 다양성과 기능적 능력을 평가할 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Doug Fro이고, j Craig Venture Institute의 Shannon Williamson 박사 연구실의 연구원입니다. 오늘은 환경 바이러스 집합체에서 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 RNA를 분리하는 절차를 보여 드리겠습니다.
이 방법은 DNA 또는 RNA를 표적으로 하는 핵 처리와 같은 기존 방법에 비해 장점이 있습니다. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피는 전체 바이러스 군집을 포착할 수 있는 능력이 있습니다. 이 방법을 통해 바이러스 생태학 분야의 몇 가지 질문에 답할 수 있습니다.
예를 들어, 전체 유전자 보체 또는 바이러스 군집의 다양성은 무엇입니까? 우리는 유전적 특징의 부분 집합을 희생하지 않고 체서피크 만에서 전체 리오 플랑크톤 군집을 연구하고 싶었을 때 이 방법을 처음 생각했습니다. 이 실험에 필요한 용액은 함께 제공되는 서면 프로토콜의 지침에 따라 미리 준비해야 하며 0.12몰 인산염 완충액, 0.20몰 인산염 완충액, 0.40몰 인산염 완충액 및 1몰 인산염 용액을 포함해야 합니다.
모두 pH 6.8 및 실험 당일 수화 하이드록시아파타이트에서 모든 인산염 완충액과 수화 하이드록시아파타이트를 섭씨 60도의 수조에 넣어 평형을 이룹니다. 바이러스 핵산 분리에 사용할 이코노 컬럼을 준비하여 이 절차를 시작합니다. 이코노 컬럼 끝에 마개를 부착하고 닫혀 있는지 확인합니다.
피펫을 사용하여 탈이온수를 컬럼에 추가한 다음 컬럼 상단에 캡을 놓고 컬럼을 반복적으로 뒤집어 헹굽니다. 물을 붓고 이 세척을 여러 번 반복하십시오. 다음으로, econ 컬럼에서 스톱 콕을 제거하고 오토클레이브하여 살균합니다.
스톱 콕은 녹기 때문에 오토클레이브가 아닙니다. 정지 콕을 이온수로 헹군 다음 다시 70% 에탄올로 헹구고 고압증기멸균 후 자연 건조시킵니다. 스톱 코크를 교체하고 닫으십시오.
다음으로, 흄 후드에서 작업하면서 컬럼에 1ml의 시그마 코트를 추가하고 그림과 같이 롤링 동작으로 컬럼을 반전시켜 컬럼 유리를 코팅합니다. 시그마 코팅으로 코팅하면 핵산이 유리 표면에 달라붙는 것을 최소화할 수 있습니다. 분리하는 동안 하나의 소금 유리 표면이 코팅되었습니다.
스톱 콕을 열고 원추형 튜브로 디캔팅합니다. 다음으로, 컬럼을 순환 수조에 연결하려면 두 개의 클램프를 사용하여 컬럼을 링 스탠드에 부착합니다. 순환하는 수조에서 실리콘 튜브를 부착하여 수조에서 물의 흐름이 아래에서 위로 흐르도록 합니다.
온도를 섭씨 60도로 설정하고 순환을 시작합니다. 실제로 기둥과 튜브는 알루미늄 호일 또는 발포 파이프 단열재와 같은 절연제로 싸여 있습니다. 열 손실을 최소화하기 위해 이 단계는 여기에 표시되지 않습니다.
절차를 더 잘 시각화하려면 스톱 콕을 닫으십시오. 파이펫터를 사용하여 10ml의 멸균 RNA 자유수를 추가합니다. 스톱 콕을 열고 물이 배수되도록 합니다.
그런 다음 두 번째 세탁 후 다시 세탁하십시오. 10ml의 멸균 RNA가 없는 0.12몰 인산염 완충액으로 두 번 헹구고 세척 사이에 디캔트를 헹굽니다. 이제 컬럼이 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용할 준비가 되었습니다.
econ 컬럼 스톱 콕이 닫혀 있는지 확인하십시오. 그런 다음 멸균 2밀리리터 혈청학 피펫을 사용하여 준비된 2밀리리터의 현탁액, 재수화된 하이드록시 식욕을 컬럼 바닥에 천천히 추가합니다. 컬럼 캡을 교체합니다.
하이드록시 식욕이 30분 동안 중력의 힘에 의해 안정되도록 합니다. 이 방법은 세부 사항에주의를 기울여야합니다. 하이드록시 식욕 컬럼은 분당 0.25-0.5mils의 속도로 처리됩니다.
따라서 기둥이 마르지 않도록 기둥을 면밀히 주시하는 것이 매우 중요합니다. 30분이 지나면 스톱 콕을 열어 버퍼를 폐기물 용기로 배출합니다. 스톱 콕을 닫고 흐름을 버립니다.
500마이크로리터의 최종 부피에서 핵산과 0.12몰 인산염 완충액을 결합하고 10분 동안 섭씨 60도에서 배양합니다. 이것은 핵산을 컬럼의 온도에 평형을 이루고 존재할 수 있는 2차 구조를 제거함으로써 다른 핵산 종의 분리를 향상시킬 것입니다. 2밀리리터 혈청학 피펫을 사용하여 핵산 용액을 하이드록시 식욕에 빠르게 도포하고 컬럼을 방해하지 않도록 합니다.
전체 500마이크로리터가 컬럼으로 흐르면 소량의 0.12몰 인산염 버퍼를 컬럼 상단에 추가하여 건조를 방지할 수 있습니다. 핵산이 하이드록시 식욕에 30분 동안 결합하도록 합니다. 결합 배양 후 컬럼 아래에 15ml 원추형 튜브를 놓습니다.
그런 다음 스톱 콕을 열고 단일 가닥 DNA가 포함된 초기 500마이크로리터 샘플을 수집합니다. 500마이크로리터가 수집되면 스톱 콕을 닫습니다. 다음으로, 6ml의 0.12 몰 인산염 완충액을 하이드록시 식욕에 첨가하여 컬럼을 방해하지 않도록 합니다.
그런 다음 스톱 콕을 열고 이전 단계와 동일한 15ml 튜브에 singlet stranded DNA가 포함된 흐름을 계속 수집합니다. 약 6밀리리터를 모은 후 스톱콕을 닫습니다. 볼텍싱(vortexing)에 의해 격렬하게 혼합된 튜브에 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 용액 1부피를 첨가한 후 15분 동안 3, 500회 G로 원심분리한다.
원심분리 후 튜브에는 두 개의 층이 포함됩니다. DNA의 단일 가닥을 포함하는 상단 무흡층을 새로운 15ml 튜브로 옮기고 샘플을 실온에 보관하여 RNA를 용리 및 정제합니다.컬럼에서 6ml의 0.20몰 인산염 완충액을 추가하고 새로운 15ml 튜브를 사용하기 전에 유동을 수집합니다. 그런 다음 페놀 클로로포름 추출을 수행합니다.
단일 가닥 DNA 샘플의 경우 6ml의 0.40 몰 인산염 완충액을 사용하여 이 과정을 반복하여 컬럼에서 이중 가닥 DNA를 용출 및 정제합니다. 마지막으로, 컬럼에서 잔류 이중선 가닥 DNA를 제거합니다. 이 과정을 한 번 더 반복합니다.
이번에는 6ml의 1.00 몰 인산염 완충액을 사용하여 핵산 샘플을 탈염했습니다. 30, 000 분자량 커트오프 매우 세포막 농축물 표본으로 장비된 anon 매우 4개의 원심 여과기 장치에 각 표본의 4-5 밀리리터를 조정 각 회전자에 있는 30 도의 섭씨에 6, 000 GS에 대략 5 분 동안 회전시켜서 500 마이크로리터 미만으로 옮기십시오. 플로우 스루를 버린 후 나머지 샘플을 필터에 추가합니다.
RNA가 없는 XTE 완충액 1개를 사용하여 부피를 최대 4-5ml까지 가져옵니다. 그런 다음 농축된 부피가 될 때까지 다시 회전합니다. 스핀 후 약 5분 후에 4-5ml의 RNA를 추가하고 하나의 XTE 완충액을 필터에 추가하고 농축합니다.
다시 말하지만, 이 세척을 반복하고 추가로 5회 더 핵산 샘플을 완전히 탈염합니다. 샘플이 완전히 농축되고 탈염되면 나머지 핵산 샘플을 멸균 1.7ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소듐 아세테이트 부피의 10분의 1, 100% 에탄올 2부피, 볼텍싱 원심분리기로 잘 혼합된 글리코 블루 1마이크로리터를 첨가하여 핵산을 침전시킵니다.
A 28, 000 GS 섭씨 4도.켄트까지 60분. 펠릿을 방해하지 않도록 하십시오.
28, 000 GS 실내 온도에 70%ethanol의 300 마이크로리터를 10 분 동안 건조할 수 없고 RNAs의 적합한 양에 있는 각 조각을 refuse 추가한다. 바이러스 핵산 M13 MP 18, 단일 가닥 DNA MS 2 단일, RNA FI 6 이중 가닥, RNA 및 lambda 이중 가닥 DNA의 유리 TE 완충액 등가농도를 결합한 다음 이 비디오와 같이 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 분리했습니다. M 13 MP 18, 단일 가닥 DNA MS 2, 단일 가닥, RNA 5 6 이중 가닥, RNA 및 Lambda 이중 가닥 DNA의 동일한 농도를 6 번 레인과 같이 결합하고 여기에서 볼 수 있듯이 하이드록시아파타이트 컬럼에 적용했습니다.
단일 가닥 D-N-A-R-N-A 및 이중 가닥 DNA는 0.12 몰, 0.18 몰, 0.40 몰 및 1.00 몰 인산염 완충액을 사용하여 Hydroxyapatite 컬럼에서 독립적으로 암시되었습니다. 게놈 크기를 확인하기 위해 1KB ladder를 사용했습니다. 이러한 결과는 이 방법이 한 분획에서 다음 분획으로 9% 미만의 캐리오버를 가진 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 RNA를 성공적으로 분리하는 데 사용할 수 있음을 나타냅니다.
이 방법은 또한 여기에서 볼 수 있듯이 체서피크 만 내의 바이러스 군집으로부터 분리된 핵산을 분리하는 데 사용되었습니다. 단일 가닥 D-N-A-R-N-A 및 이중 가닥 DNA는 0.12 몰, 0.20 몰 및 0.40 몰 또는 각각 1.00 몰의 인산염 완충액 농도를 사용하여 독립적으로 암시되었으며, 1 번 레인의 높은 질량 DNA 사다리와 2 번 레인의 1 KB 사다리를 사용하여 핵산의 대략적인 분자량과 질량을 시각적으로 확인했습니다. 이중 가닥 DNA는 Chesapeake Bay Verio 플랑크톤에서 추출한 우성 핵산 유형이었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 혼합 바이러스 집합체에서 핵산을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
여기에는 Hydroxyapatite 컬럼 및 핵산의 준비, 다양한 농도의 인산염 완충액 및 탈염을 사용한 핵산의 분리 및 착시, 분리 후 핵산 농축이 포함됩니다.
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개요
이 기사는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 환경 바이러스 군집에서 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 및 RNA를 분리하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 다양한 바이러스 핵산 유형의 분리를 가능하게 하여, 바이러스의 다양성 및 기능성에 대한 추가 연구를 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 바이러스학
- 분자 생물학
- 환경 과학
배경
- 환경 바이러스 군집은 복잡하고 다양합니다.
- 환경 생태계에서의 역할을 연구하기 위해서는 바이러스 핵산을 이해하는 것이 중요합니다.
- 기존의 방법은 다른 핵산 유형을 효과적으로 분리하지 못할 수 있습니다.
- 하이드록시아파타이트 크로마토그래피는 이러한 분리에 대한 유망한 해결책을 제공합니다.
연구 목적
- 바이러스 핵산을 분리하는 효율적인 방법을 개발하기 위함입니다.
- 바이러스 분류학적 다양성에 대한 이해를 향상시키기 위함입니다.
- 시퀀싱을 포함한 추가 분석을 위해 핵산을 준비하기 위함입니다.
사용된 방법
- 핵산 분리를 위해 하이드록시아파타이트 크로마토그래피가 사용되었습니다.
- 컬럼이 인산염 완충액으로 채워지고 평형화되었습니다.
- 핵산이 컬럼에 적용되고 순차적으로 용출되었습니다.
- 전기영동을 사용하여 분리 효율을 확인했습니다.
주요 결과
- 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 및 RNA가 성공적으로 분리되었습니다.
- 9% 미만의 핵산 반출이 관찰되었습니다.
- 이 방법은 핵산의 효과적인 시각화 및 정량화를 가능하게 합니다.
- 결과는 환경 샘플에서 바이러스 군집에 대한 연구를 지원합니다.
결론
- 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 방법은 핵산 분리에 효율적입니다.
- 이 기술은 바이러스 다양성 및 기능성에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
- 미래 연구는 이 방법을 바탕으로 바이러스학에서의 더 넓은 적용을 위해 연구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Separating nucleic acid subtypes from mixed viral assemblages enables comprehensive characterization of viral diversity without losing genetic signatures, supporting target validation in antiviral discovery. Hydroxyapatite chromatography provides a scalable, reproducible method to isolate ssDNA, dsDNA, and RNA viruses for downstream sequencing and functional assays. This approach reduces mechanistic ambiguity in early discovery by enabling parallel evaluation of all viral genome types in environmental samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses across all viral genome types in complex assemblages.
- Operational Value: Supports biological de-risking by preserving ssDNA, dsDNA, and RNA viral signatures for parallel target screening.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative nucleic acid yields for each subtype prior to lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, fractionated viral nucleic acid pools for assay development against diverse viral targets.
- Operational Value: Ensures assay readiness through reproducible separation with <9% carryover, enabling reliable compound screening.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple viral community samples with consistent elution profiles using defined phosphate buffer gradients.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from environmental viral sampling to preclinical validation by preserving genotype-specific nucleic acids.
- Mechanistic De-risking: Enables assessment of functional potential across ssDNA, dsDNA, and RNA viruses to inform preclinical model selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing subtype-specific quantification for biomarker alignment in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling fractionation of viral nucleic acids prior to sequencing, assay development, and functional screening, supporting lead identification campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating ssDNA, dsDNA, and RNA viruses for independent functional analysis.
- Screening: Delivers assay-ready nucleic acid fractions with high purity and low carryover, enabling reliable high-throughput screening.
- Analytics: Provides quantitative nucleic acid yields and electrophoretic profiles that allow comparison across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects environmental sampling to preclinical continuity through preserved nucleic acid integrity for downstream validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fractionation platform applicable to diverse viral assemblages across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through comprehensive viral genome representation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of nucleic acid separation across labs.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on complete viral diversity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and chromatography techniques.
- Dependence on HPLC-compatible systems and fraction collection infrastructure.
- Need for standardized phosphate buffer preparation and temperature control at 60°C.
- Adaptation considerations for varying viral load and sample complexity from environmental sources.
- Practical limitation: Column equilibration and binding steps require precise timing to prevent nucleic acid degradation or loss.
