Name: 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: 배우세요 히드록시아파이트 크로마토그래피를 사용하여 환경 바이러스 커뮤니티에서 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA 및 RNA를 분리하는 방법을 배우세요. 이 기술은 바이러스 다양성 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 과학 사무소 (BER), 에너지의 미국학과, 아니 계약의 협동에 의해 지원되었다. 드 FC02 - 02ER63453, 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 미생물 게놈 시퀀싱 프로그램 (보너스 번호 0,626,826 및 0,731,916). 우리는 환경 샘플 컬렉션과 함께 자신의 지원에 대한 그의 기술적 전문성과 조언과 K. 에릭 Wommack에 대한 존 유리 주셔서 감사합니다.

1. 솔루션의 준비 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 수행하기 전에, 인산 버퍼가 준비되어야하며 히드록 시아파 타이트가 제대로 수산화해야합니다. <ol><li> 1M 인산 솔루션, 산도 6.8가 : 1L 플라스크에 살균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 일염기의의 119.98g 디졸브 무균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 이염의 141.96g를 용해하여 1L 플라스크에 1M 인산 나트륨 이염 솔루션을 준비 1시 1분의 비율로 모노 및 디 - 솔루션을 결합합니다. 저어 플레이트와 자기 볶음 막대를 사용하여 혼합에 장소 술병. 수산화 나트륨 (산도를 증가) 또는 인산을 (산도를 감소)을 추가하여 6.8으로 산도를 조정합니다. </li><li> 0.12M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 30ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.18M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 45ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.20M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml에 50ml을 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.40 M 인산 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 100ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> "1.00M 인산 버퍼는"(이 용액에 인산염의 실제 농도가 0.91 M입니다) : 500ml 플라스크에 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 1M 인산 솔루션, pH6.8, 2.5ml의 30ml 결합하고, 5ml의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5M. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 히드록 시아파 타이트 수화 : 히드록 시아파 타이트의 1g 밖에 무게와 50ml 튜브에 추가할 수 있습니다. 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 6ml를 추가하고 섞어 반전. 이전 60 온도를 가져다 사용하는 ° C와 철저히 섞는다. 4 장시간 보관 ° C. </li><li> 사용하기 전에, 60 ° C. 모든 인산염 버퍼 및 수산화 히드록 시아파 타이트를 평형 </li></ol> 2. 이코노 - 열 준비 <ol><li> 꼭지를 닫습니다. 반복 반전 열의와 decanting로 deionized H 2 O와 열을 여러 번 씻어. </li><li> 이코노 열에서 꼭지를 제거하고 소독하는 열을 압력솥. </li><li> 교체 및 꼭지를 닫습니다. 이코노 열 살균와 코트 모든 유리 표면에 Sigmacote의 1ml을 추가합니다. 꼭지와 가만히 따르다를 엽니다. </li><li> 순환 물 목욕으로 컬럼을 첨부하고 60 온도를 설정할 ° C. 이러한 알루미늄 호일이나 발포 파이프 단열재로 단열 대리인의 컬럼을 포장 열 전체 열 손실의 최소 금액을 einsure하기 위해하는 것은 권장합니다. </li><li> 무균, RNase - 무료 0.12M 인산염 버퍼로 두 번 누른 다음 멸균, RNase 무료 H 2 O와 두 번 이코노 - 컬럼을 씻어. </li></ol> 3. Hydroxypaptite의 Chromotography <ol><li> 확실히 만드는 것은 꼭지가 닫혀 천천히 살균 2ml serological 피펫을 사용하여 이코노 - 칼럼의 맨 아래에 미리 준비 resuspended 히드록 시아파 타이트의 2ml 추가합니다. </li><li> 히드록 시아파 타이트가 30 분 동안 중력에 따라 해결하도록 허용합니다. </li><li> 열에 가까이 꼭지에서 버퍼를 드레인. 60 ° 열 블록이나 물을 욕조에 10 분 C. 500 μl와 부화의 최종 볼륨 0.12M 인산염 버퍼와 핵산을 결합 </li><li> 신속하게 열을 방해하지 않도록하는 2ml serological 피펫을 사용하여 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 준비 핵산을 적용합니다. </li><li> 핵산 30 분 동안 히드록 시아파 타이트에 바인딩을 허용합니다. </li><li> 열 아래 15ml 튜브를 삽입, 꼭지를 열고 ssDNA를 포함하는 초기 샘플을 수집합니다. 꼭지를 닫습니다. </li><li> , 컬럼 방해 꼭지를 열고 이전 단계에서 15ml 튜브 단일 좌초된 DNA를 수집하지 않도록하는 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 6ml를 추가합니다. 꼭지를 닫습니다. </li><li> 클로로포름 : 페놀 1 볼륨을 추가 isoamyl 알코올 (25:25:1 V / V / V) 튜브에 솔루션을 적극적으로 섞어 15 분 3,500 XG에 원심 분리기. 새로운 15ml 튜브에 뜨는 포함 ssDNA를 전송합니다. </li><li> 전자에 0.20M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복칼럼에서 류트와 정화 RNA는 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하고. </li><li> 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하는 컬럼의 dsDNA를 elute 및 정화 0.40M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복합니다. </li><li> 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하고 잔여 dsDNA의 열을 제거하기 위해서 1.00M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복합니다. </li></ol> 4. 핵산 샘플을 탈염 <ol><li> 샘플의 양도 4 - 5ml Amicon 울트라 - 4 Ultracel 막 잘라 30,000 분자량과 함께 장착된 필터 원심 장치. </li><li> 6000 XG, 30 회전에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치 샘플 (들)의 나머지 부분을 추가하고 Rnase 무료 1X TE 버퍼와 함께 4 - 5ml에 볼륨을 가져. </li><li> 6000 XG, 30 회전에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치에 Rnase 무료 1X TE 버퍼 4 - 5ml를 추가합니다. 6000 XG, 30 centrifuging에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 완전히 핵산 샘플 (들) 탈염하다 단계 4.5에게 추가 5 회 반복합니다. </li><li> 멸균 1.7ml eppendorf 튜브에 남은 샘플 (들)을 전송합니다. 1/10th 볼륨 3M의 아세트산 나트륨, 산도 7.0, 100 % 에탄올 두 권, 그리고 Glycoblue의 1μl를 추가합니다. vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 28,000 XG, 4 ° C, 60 분 원심 분리기. 가만히 따르다는 펠렛을 방해하지 않도록하고. 70 % 에탄올의 300μl를 추가합니다. 10 분 28,000 XG, 상온에서 스핀. , 가만히 따르다 건조하고 Rnase없는 TE 버퍼의 적절한 볼륨의 각 부분을 resuspend. </li></ol> 5. 대표 결과 : 그림 1은 혼합 바이러스 조립에서 분류 ssDNA, dsDNA와 RNA 핵산에 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하는 제시 방법을 요약한 것입니다. 이 방법은 핵산의 부정 청구 인산염 백본과 긍정적인 요금 칼슘이 사이의 요금 상호 작용을 악용 + 이온은 히드록 시아파 타이트에있는 증가 인산염 버퍼 농도와 핵산 subtypes의 효율적인 분류 (ssDNA, dsDNA와 RNA)를 허용 12. 알려진 ssDNA (M13mp18), dsDNA (람다)와 RNA의 체외 "커뮤니티"에의 히드록 시아파 타이트 분류는 (MS2 및 phi6) 바이러스 genomes은 그림 2에서 보여주고있다. 핵산은 동일한 농도에서 결합 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용 인산염 버퍼의 증가 농도를 사용 eluted 하였다. 각 핵산 subtype 미만 9%는 다음 한 분수에서 - 이월와 다른 독립 elutes. 체사피크 베이에서 수집한 바이러스 공동체로부터 격리 핵산이 기술의 응용 프로그램은 그림 3에 표시됩니다. 정화 바이러스로부터 격리 총 핵산 수율이 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었다. ssDNA, RNA 및 dsDNA 구성된 게놈 자료는 독립적으로 각각 0.12M, 0.20M 및 인산 버퍼의 0.40M/1.00M 농도와 eluted했다. 두 번 좌초 DNA가 0.40M 및 1.00M의 인산 농도에 eluted이 경우, ssDNA와 RNA genotypes에 비해이 바이러스 공동체를 지배합니다. 이 관찰 복구할 핵산의 대부분 dsDNA 13아르 예상 바이러스 해양의 지역 사회 조성과 estuarine 환경과 일치합니다. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 핵산의 분류에 대한 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법을 그림 1. 흐름 다이어그램. 0.12M 인산염 버퍼 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA의 혼합물은 60 ° C로 가열하여 일정한 60 유지 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되는 ° C 순환 물 목욕을 사용합니다. 핵산 (ssDNA, RNA 및 dsDNA)은 인산염 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트에서 eluted 있습니다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 알려진 바이러스 핵산의 분리. M13mp18 ssDNA, ssRNA MS2, phi6 dsRNA 및 람다 dsDNA (각각 2-5 차선)의 동일한 농도는 결합 (레인 6)와 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었습니다. SinglE - 좌초된 DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6)와 dsDNA (람다)가 독립적으로 0.12M (레인 8), 0.18M (레인 9)와 0.40M/1.00M (레인 10)를 사용하여 히드록 시아파 타이트 칼럼에서 eluted되었습니다 . 1킬로바이트 사다리 (레인 1, 7) 게놈 크기를 확인하는 데 사용되었다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 체사피크 베이 내에서 지역 사회에서 격리 바이러스 핵산의 분리. 핵산은 고립과 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었습니다. ssDNA (레인 0.12M), RNA (레인 0.20M)와 dsDNA는 (차선 0.40M/1.0M) 독립적으로 각각 0.12M, 0.20M 및 0.40M/1.00M의 인산염 버퍼 농도를 사용하여 eluted되었습니다. 안녕 질량 DNA 사다리 (레인 L1)와 1킬로바이트 사다리 (레인 L2)는 시각 핵산의 대략적인 분자량 및 질량을 확인하는 데 사용되었습니다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12.

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<li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+Evolution+of+the+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법론 목표가 지역 사회의 총 핵산 성분을 연구하는 혼합 바이러스 assemblages에서 핵산의 분별 (분리)를위한 고효율하고 강력한 도구입니다. 일반적으로, ssDNA, RNA 및 dsDNA은 약 ~ 0and 0.40M 각각보다 큰 열을 검사하고 사진을 인산염 버퍼 농도에서 elute 것입니다. 그것이 알려진 핵산을 (재배 바이러스 준비의 예)를 사용하여 각각의 준비를 테스트하는 것이 중요하므로 단, 히드록 시아파 타이트의 각 준비는 약간 다른 구성과 용출 프로필을 가질 수 있습니다. 이것은 사용자가 원하는 핵산을 elute에 필요한 인산염 함유 버퍼의 특정 농도를 확인할 수 있습니다. 이 기법의 제한 요소를 사용할 수 칼슘 2의 수량 핵산의 인산 백본을 바인딩할 수 히드록 시아파 타이트에있는 + 이온입니다. 열에있는 히드록 시아파 타이트의 capacityamount은...

<table border="1"><tbody><tr><th> 재료 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 이코노 - 열 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm 아이디 패키지 / 2 </td></tr><tr><td> 히드록 시아파 타이트 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 130-0520 </td><td> DNA 학년 바이오 젤 HTP 젤, 100g/td&gt; </tr><tr><td> 인산 나트륨, 일염기의 </td><td> VWR </td><td> VW1497 - 01 </td><td> 일수화물, 크리스탈 500g </td></tr><tr><td> 인산 나트륨, 이염 </td><td> VWR </td><td> VW1496 - 01 </td><td> 무수, 파우더 500g </td></tr><tr><td> DEPC - 처리된 물 </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> UltraPure, 1L </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> 산도 8.0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> SL2 - 25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml serological pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> 폴리스티렌, 무균 </td></tr><tr><td> BD 팔콘의 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, 무균 </td></tr><tr><td> 페놀 : 클로로포름 : Isoamyl 알코올 (25:24:1 V / V / V) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> UltraPure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 - 4 원심 장치 </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel - 30 멤브레인 </td></tr><tr><td> 20X TE 버퍼, Rnase 무료 </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 dna, 더블 좌초된 dna와 rna의 분리

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

바이러스, 특히 bacteriophages은 (phages), 지구 1,2에서 가장 많은 생물 학적 실체입니다. 바이러스가 숙주 세포의 풍요로움과 다양성을 조절, 영양분의 순환에 기여, 세포 표현형를 호스팅 변경, 그리고 유전자 3의 측면 전송을 통해 숙주 세포와 바이러스 모두 지역 사회의 진화에 영향을 미칩니다. 많은 연구는 바이러스 및 자연 환경의 다양한 기능들이 잠재력의 압도적인 유전적 다양성을 강조했습니다. Metagenomic 기술은 taxonomic의 다양성과 회원 단일 좌초된 DNA (ssDNA), 두 번 좌초 DNA (dsDNA)와 RNA의 genotypes 4-9를 포함하는 복잡한 바이러스 assemblages의 기능 잠재력을 연구하는 데 사용되었습니다. 환경 DNA 함유 바이러스를하거나 RNA 함유를 연구하는 데 사용되는 현재 도서관 건설 프로토콜 nontargeted 템플릿 10을 제거하기 위해 초기 nuclease 치료를 필요로합니다. 그러나, 바이러스 지역 사회와 바이러스의 다양성의 집단 유전자 보완의 포괄적인 이해 관계 게놈 구성의 모든 구성원에 대한 지식이 필요합니다. 핵산 subtypes을 정화의 분류는 지역 사회의 유전자 서명의 일부를 희생하지 않고도 바이러스 assemblages을 연구하는 효과적인 메커니즘을 제공합니다. 히드록 시아파 타이트, 인산 칼슘의 결정 형태는 1960 년대 11 일 이후, 핵산의 분리뿐만 아니라 단백질과 미생물에서 채용되었습니다. 긍정적 - 충전 칼슘 2 사이 충전 상호 작용을 이용하여 + 히드록 시아파 타이트와 핵산 subtypes의 부정 청구 인산염 백본의 이온은, 그것이 우선적으로 다른 독립적인 각각의 핵산 subtype을 elute 수 있습니다. 우리는 최근에 DNA 시퀀싱 12 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA 함유 바이러스 독립적으로 분류 genomes이 전략을 고용. 여기, 우리는 히드록 시아파 타이트 chromotography를 사용하여 혼합 바이러스 assemblages에서 ssDNA, dsDNA와 RNA 바이러스 핵산의 분류 및 복구를위한 방법을 제시한다.

우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

바이러스, 특히 박테리오파지(파지)는 지구상에서 가장 수가 많은 생물학적 개체입니다1,2. 바이러스는 숙주 세포의 풍부도와 다양성을 조절하며, ...

이 영상은 핵산 조성에 기반하여 혼합 바이러스 군집을 분리하는 절차를 보여줍니다. 이를 통해 복잡한 바이러스 군집의 분류학적 다양성과 기능적 잠재력을 연구할 수 있습니다. 여기서는 인산 칼슘의 결정 형태인 하이드록시아파타이트가 핵산 분리에 사용됩니다.먼저, Hydroxyapatite 컬럼을 충전하고 평형화한 후 정제된 바이러스 핵산을 컬럼에 적용합니다. Hydroxyapatite의 양전하를 띤 칼슘 이온과 핵산 아형의 음전하를 띤 인산 골격 사이의 전하 상호작용을 통해 핵산이 컬럼에 결합됩니다. 다음으로 단일 가닥 DNA/RNA 및 이중 가닥 DNA를 서로 다른 농도의 인산염 완충액으로 순차적으로 용리합니다. 이렇게 얻은 핵산은 탈염 및 농축 과정을 거쳐 시각화, 정량화 및 DNA 시퀀싱을 통한 식별 준비를 합니다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 핵산 종이 9% 미만의 carryover로 분리될 수 있음을 확인합니다.따라서 이 방법을 통해 바이러스 군집의 다양성과 기능적 용량을 평가할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 j Craig Venture Institute의 Shannon Williamson 박사 연구실 연구원으로 근무하고 있는 Doug Fro입니다. 오늘은 환경 바이러스 어셈블리지에서 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 RNA를 분리하는 절차를 보여드리겠습니다.이 방법은 DNA 또는 RNA를 대상으로 하는 핵 처리와 같은 기존 방법보다 장점이 있습니다. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피는 전체 바이러스 군집을 포집할 수 있는 능력이 있습니다. 이 방법을 통해 바이러스 생태학 분야의 여러 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.예를 들어, 전체 유전자 보충물이나 바이러스 커뮤니티의 다양성은 어느 정도일까요? 저희는 유전적 특징의 일부를 희생시키지 않고 체사피크만(Chesapeake Bay)의 전체 리오 플랑크톤(Rio Plankton) 군집을 연구하고자 했을 때 처음으로 이 방법을 생각했습니다. 이 실험에 필요한 용액들은 함께 제공된 서면 프로토콜의 지침에 따라 미리 준비해야 하며, 여기에는 0.12 molar 인산염 완충액, 0.20 molar 인산염 완충액, 0.40 molar 인산염 완충액 및 1 molar 인산염 용액이 포함됩니다.pH 6.8 및 수화된 하이드록시아파타이트(hydrated hydroxyapatite) 조건 하에, 실험 당일 모든 인산염 완충액과 수화된 하이드록시아파타이트를 60°C

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 정화를 위해 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 다음 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출을위한 방법을 설명합니다.

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

우리는 hypersaline 미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA를 추출하기위한 개선된 프로토콜을 제공합니다. 미생물 세포는 DNA 추출 및 정화하기 전에 매트 매트릭스에서 분리됩니다. 이것은 농도, 품질 및 DNA의 크기를 향상시킵니다. 프로토콜은 다른 내화물 샘플에 사용할 수 있습니다.

미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출

Isotachophoresis (ITP)는 독소 검출에서 샘플 준비에 이르기까지 다양한 애플 리케이션과 강력한 계면 분리 및 preconcentration 기술입니다. 분리와 작은 분자 및 세포 배양 lysate로부터 핵산 정화의 검출 : 우리는 ITP의 물리적 원리와 두 구체적인 예를 들어 응용 프로그램에이 기법을 적용하는 방법론을 검토합니다.

이온의 분리 및 핵산의 정화를위한 온칩 Isotachophoresis

단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

출처: Dembowski, J. A., 외. 연관 바이러스 및 세포 단백질 식별을 위한 바이러스 DNA 정제. J. Vis. Exp. (2017). 이 비디오는 클릭 화학 및 자기 비드 정제를 사용하여 세포핵에서 단백질-바이러스 DNA 복합체를 분리하는 과정을 보여줍니다. 프로토콜에는 알킨 수정 뉴클레오타이드를 이용한 바이러스 게놈 표지, 클릭 반응을 통한 비오틴화, 그리고 스트렙타비딘 코팅 자기 비드에의 결합 과정이 포함됩니다. 세척 및 열 용출 후, 정제된 복합체를 수집하고 급속 냉동하여 후속 분석을 위해 보관합니다. Dembowski, J. A., 외.연관된 바이러스 및 세포 단백질 식별을 위한 바이러스 DNA 정제. J. Vis. Exp.. (2017).이 영상은 클릭 화학과 자성 비드 정제를 이용하여 세포 핵으로부터 단백질-바이러스 DNA 복합체를 분리하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜에는 알킨-수식 뉴클레오타이드로 바이러스 게놈을 표지하고, 클릭 반응을 통해 비오틴화한...

바이러스 DNA-단백질 복합체로부터의 단백질 분리

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

여기에서는 외딴 해양 환경에서 유기 및 무기 영양소 가용성과 미생물 및 바이러스 군집의 풍부함 및 구조를 평가하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

우리는 16S rRNA의 유전자의 증폭 시퀀싱을 사용하여 세균 지역 사회의 특성에 대한 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고 하류 공정 분석들을 수용한다.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 추출을 가속화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 표준 스윙 버킷 플레이트 로터와 호환되는 맞춤형 3D 프린팅 랙을 활용함으로써, 연구자들은 캡이 있는 최대 48개의 스핀 컬럼 또는 캡 없이 최대 116개의 스핀 컬럼을 동시에 처리할 수 있어 수동 마이크로 원심분리기 방식에 비해 취급 시간을 크게 줄일 수 있습니다.

24웰 랙을 이용한 중간 처리량 컬럼 DNA 추출

배우세요 히드록시아파이트 크로마토그래피를 사용하여 환경 바이러스 커뮤니티에서 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA 및 RNA를 분리하는 방법을 배우세요. 이 기술은 바이러스 다양성 연구에 활용됩니다.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

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