Name: 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: 배우세요 히드록시아파이트 크로마토그래피를 사용하여 환경 바이러스 커뮤니티에서 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA 및 RNA를 분리하는 방법을 배우세요. 이 기술은 바이러스 다양성 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 과학 사무소 (BER), 에너지의 미국학과, 아니 계약의 협동에 의해 지원되었다. 드 FC02 - 02ER63453, 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 미생물 게놈 시퀀싱 프로그램 (보너스 번호 0,626,826 및 0,731,916). 우리는 환경 샘플 컬렉션과 함께 자신의 지원에 대한 그의 기술적 전문성과 조언과 K. 에릭 Wommack에 대한 존 유리 주셔서 감사합니다.

1. 솔루션의 준비 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 수행하기 전에, 인산 버퍼가 준비되어야하며 히드록 시아파 타이트가 제대로 수산화해야합니다. <ol><li> 1M 인산 솔루션, 산도 6.8가 : 1L 플라스크에 살균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 일염기의의 119.98g 디졸브 무균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 이염의 141.96g를 용해하여 1L 플라스크에 1M 인산 나트륨 이염 솔루션을 준비 1시 1분의 비율로 모노 및 디 - 솔루션을 결합합니다. 저어 플레이트와 자기 볶음 막대를 사용하여 혼합에 장소 술병. 수산화 나트륨 (산도를 증가) 또는 인산을 (산도를 감소)을 추가하여 6.8으로 산도를 조정합니다. </li><li> 0.12M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 30ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.18M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 45ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.20M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml에 50ml을 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.40 M 인산 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 100ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> "1.00M 인산 버퍼는"(이 용액에 인산염의 실제 농도가 0.91 M입니다) : 500ml 플라스크에 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 1M 인산 솔루션, pH6.8, 2.5ml의 30ml 결합하고, 5ml의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5M. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 히드록 시아파 타이트 수화 : 히드록 시아파 타이트의 1g 밖에 무게와 50ml 튜브에 추가할 수 있습니다. 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 6ml를 추가하고 섞어 반전. 이전 60 온도를 가져다 사용하는 ° C와 철저히 섞는다. 4 장시간 보관 ° C. </li><li> 사용하기 전에, 60 ° C. 모든 인산염 버퍼 및 수산화 히드록 시아파 타이트를 평형 </li></ol> 2. 이코노 - 열 준비 <ol><li> 꼭지를 닫습니다. 반복 반전 열의와 decanting로 deionized H 2 O와 열을 여러 번 씻어. </li><li> 이코노 열에서 꼭지를 제거하고 소독하는 열을 압력솥. </li><li> 교체 및 꼭지를 닫습니다. 이코노 열 살균와 코트 모든 유리 표면에 Sigmacote의 1ml을 추가합니다. 꼭지와 가만히 따르다를 엽니다. </li><li> 순환 물 목욕으로 컬럼을 첨부하고 60 온도를 설정할 ° C. 이러한 알루미늄 호일이나 발포 파이프 단열재로 단열 대리인의 컬럼을 포장 열 전체 열 손실의 최소 금액을 einsure하기 위해하는 것은 권장합니다. </li><li> 무균, RNase - 무료 0.12M 인산염 버퍼로 두 번 누른 다음 멸균, RNase 무료 H 2 O와 두 번 이코노 - 컬럼을 씻어. </li></ol> 3. Hydroxypaptite의 Chromotography <ol><li> 확실히 만드는 것은 꼭지가 닫혀 천천히 살균 2ml serological 피펫을 사용하여 이코노 - 칼럼의 맨 아래에 미리 준비 resuspended 히드록 시아파 타이트의 2ml 추가합니다. </li><li> 히드록 시아파 타이트가 30 분 동안 중력에 따라 해결하도록 허용합니다. </li><li> 열에 가까이 꼭지에서 버퍼를 드레인. 60 ° 열 블록이나 물을 욕조에 10 분 C. 500 μl와 부화의 최종 볼륨 0.12M 인산염 버퍼와 핵산을 결합 </li><li> 신속하게 열을 방해하지 않도록하는 2ml serological 피펫을 사용하여 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 준비 핵산을 적용합니다. </li><li> 핵산 30 분 동안 히드록 시아파 타이트에 바인딩을 허용합니다. </li><li> 열 아래 15ml 튜브를 삽입, 꼭지를 열고 ssDNA를 포함하는 초기 샘플을 수집합니다. 꼭지를 닫습니다. </li><li> , 컬럼 방해 꼭지를 열고 이전 단계에서 15ml 튜브 단일 좌초된 DNA를 수집하지 않도록하는 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 6ml를 추가합니다. 꼭지를 닫습니다. </li><li> 클로로포름 : 페놀 1 볼륨을 추가 isoamyl 알코올 (25:25:1 V / V / V) 튜브에 솔루션을 적극적으로 섞어 15 분 3,500 XG에 원심 분리기. 새로운 15ml 튜브에 뜨는 포함 ssDNA를 전송합니다. </li><li> 전자에 0.20M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복칼럼에서 류트와 정화 RNA는 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하고. </li><li> 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하는 컬럼의 dsDNA를 elute 및 정화 0.40M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복합니다. </li><li> 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하고 잔여 dsDNA의 열을 제거하기 위해서 1.00M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복합니다. </li></ol> 4. 핵산 샘플을 탈염 <ol><li> 샘플의 양도 4 - 5ml Amicon 울트라 - 4 Ultracel 막 잘라 30,000 분자량과 함께 장착된 필터 원심 장치. </li><li> 6000 XG, 30 회전에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치 샘플 (들)의 나머지 부분을 추가하고 Rnase 무료 1X TE 버퍼와 함께 4 - 5ml에 볼륨을 가져. </li><li> 6000 XG, 30 회전에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치에 Rnase 무료 1X TE 버퍼 4 - 5ml를 추가합니다. 6000 XG, 30 centrifuging에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 완전히 핵산 샘플 (들) 탈염하다 단계 4.5에게 추가 5 회 반복합니다. </li><li> 멸균 1.7ml eppendorf 튜브에 남은 샘플 (들)을 전송합니다. 1/10th 볼륨 3M의 아세트산 나트륨, 산도 7.0, 100 % 에탄올 두 권, 그리고 Glycoblue의 1μl를 추가합니다. vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 28,000 XG, 4 ° C, 60 분 원심 분리기. 가만히 따르다는 펠렛을 방해하지 않도록하고. 70 % 에탄올의 300μl를 추가합니다. 10 분 28,000 XG, 상온에서 스핀. , 가만히 따르다 건조하고 Rnase없는 TE 버퍼의 적절한 볼륨의 각 부분을 resuspend. </li></ol> 5. 대표 결과 : 그림 1은 혼합 바이러스 조립에서 분류 ssDNA, dsDNA와 RNA 핵산에 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하는 제시 방법을 요약한 것입니다. 이 방법은 핵산의 부정 청구 인산염 백본과 긍정적인 요금 칼슘이 사이의 요금 상호 작용을 악용 + 이온은 히드록 시아파 타이트에있는 증가 인산염 버퍼 농도와 핵산 subtypes의 효율적인 분류 (ssDNA, dsDNA와 RNA)를 허용 12. 알려진 ssDNA (M13mp18), dsDNA (람다)와 RNA의 체외 "커뮤니티"에의 히드록 시아파 타이트 분류는 (MS2 및 phi6) 바이러스 genomes은 그림 2에서 보여주고있다. 핵산은 동일한 농도에서 결합 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용 인산염 버퍼의 증가 농도를 사용 eluted 하였다. 각 핵산 subtype 미만 9%는 다음 한 분수에서 - 이월와 다른 독립 elutes. 체사피크 베이에서 수집한 바이러스 공동체로부터 격리 핵산이 기술의 응용 프로그램은 그림 3에 표시됩니다. 정화 바이러스로부터 격리 총 핵산 수율이 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었다. ssDNA, RNA 및 dsDNA 구성된 게놈 자료는 독립적으로 각각 0.12M, 0.20M 및 인산 버퍼의 0.40M/1.00M 농도와 eluted했다. 두 번 좌초 DNA가 0.40M 및 1.00M의 인산 농도에 eluted이 경우, ssDNA와 RNA genotypes에 비해이 바이러스 공동체를 지배합니다. 이 관찰 복구할 핵산의 대부분 dsDNA 13아르 예상 바이러스 해양의 지역 사회 조성과 estuarine 환경과 일치합니다. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 핵산의 분류에 대한 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법을 그림 1. 흐름 다이어그램. 0.12M 인산염 버퍼 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA의 혼합물은 60 ° C로 가열하여 일정한 60 유지 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되는 ° C 순환 물 목욕을 사용합니다. 핵산 (ssDNA, RNA 및 dsDNA)은 인산염 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트에서 eluted 있습니다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 알려진 바이러스 핵산의 분리. M13mp18 ssDNA, ssRNA MS2, phi6 dsRNA 및 람다 dsDNA (각각 2-5 차선)의 동일한 농도는 결합 (레인 6)와 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었습니다. SinglE - 좌초된 DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6)와 dsDNA (람다)가 독립적으로 0.12M (레인 8), 0.18M (레인 9)와 0.40M/1.00M (레인 10)를 사용하여 히드록 시아파 타이트 칼럼에서 eluted되었습니다 . 1킬로바이트 사다리 (레인 1, 7) 게놈 크기를 확인하는 데 사용되었다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 체사피크 베이 내에서 지역 사회에서 격리 바이러스 핵산의 분리. 핵산은 고립과 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었습니다. ssDNA (레인 0.12M), RNA (레인 0.20M)와 dsDNA는 (차선 0.40M/1.0M) 독립적으로 각각 0.12M, 0.20M 및 0.40M/1.00M의 인산염 버퍼 농도를 사용하여 eluted되었습니다. 안녕 질량 DNA 사다리 (레인 L1)와 1킬로바이트 사다리 (레인 L2)는 시각 핵산의 대략적인 분자량 및 질량을 확인하는 데 사용되었습니다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12.

<ol><li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotes%3A+The+Unseen+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+evolution+of+the+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Popul+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li>
<li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+Evolution+of+the+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li>
<li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li>
<li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay%3A+Implications+for+Prophage+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li>
<li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition%3A+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li>
<li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Viruses+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li>
<li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li>
<li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li>
<li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li>
<li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li>
<li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA%2C+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li>
<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법론 목표가 지역 사회의 총 핵산 성분을 연구하는 혼합 바이러스 assemblages에서 핵산의 분별 (분리)를위한 고효율하고 강력한 도구입니다. 일반적으로, ssDNA, RNA 및 dsDNA은 약 ~ 0and 0.40M 각각보다 큰 열을 검사하고 사진을 인산염 버퍼 농도에서 elute 것입니다. 그것이 알려진 핵산을 (재배 바이러스 준비의 예)를 사용하여 각각의 준비를 테스트하는 것이 중요하므로 단, 히드록 시아파 타이트의 각 준비는 약간 다른 구성과 용출 프로필을 가질 수 있습니다. 이것은 사용자가 원하는 핵산을 elute에 필요한 인산염 함유 버퍼의 특정 농도를 확인할 수 있습니다. 이 기법의 제한 요소를 사용할 수 칼슘 2의 수량 핵산의 인산 백본을 바인딩할 수 히드록 시아파 타이트에있는 + 이온입니다. 열에있는 히드록 시아파 타이트의 capacityamount은...

<table border="1"><tbody><tr><th> 재료 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 이코노 - 열 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm 아이디 패키지 / 2 </td></tr><tr><td> 히드록 시아파 타이트 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 130-0520 </td><td> DNA 학년 바이오 젤 HTP 젤, 100g/td&gt; </tr><tr><td> 인산 나트륨, 일염기의 </td><td> VWR </td><td> VW1497 - 01 </td><td> 일수화물, 크리스탈 500g </td></tr><tr><td> 인산 나트륨, 이염 </td><td> VWR </td><td> VW1496 - 01 </td><td> 무수, 파우더 500g </td></tr><tr><td> DEPC - 처리된 물 </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> UltraPure, 1L </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> 산도 8.0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> SL2 - 25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml serological pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> 폴리스티렌, 무균 </td></tr><tr><td> BD 팔콘의 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, 무균 </td></tr><tr><td> 페놀 : 클로로포름 : Isoamyl 알코올 (25:24:1 V / V / V) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> UltraPure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 - 4 원심 장치 </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel - 30 멤브레인 </td></tr><tr><td> 20X TE 버퍼, Rnase 무료 </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 dna, 더블 좌초된 dna와 rna의 분리

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

바이러스, 특히 bacteriophages은 (phages), 지구 1,2에서 가장 많은 생물 학적 실체입니다. 바이러스가 숙주 세포의 풍요로움과 다양성을 조절, 영양분의 순환에 기여, 세포 표현형를 호스팅 변경, 그리고 유전자 3의 측면 전송을 통해 숙주 세포와 바이러스 모두 지역 사회의 진화에 영향을 미칩니다. 많은 연구는 바이러스 및 자연 환경의 다양한 기능들이 잠재력의 압도적인 유전적 다양성을 강조했습니다. Metagenomic 기술은 taxonomic의 다양성과 회원 단일 좌초된 DNA (ssDNA), 두 번 좌초 DNA (dsDNA)와 RNA의 genotypes 4-9를 포함하는 복잡한 바이러스 assemblages의 기능 잠재력을 연구하는 데 사용되었습니다. 환경 DNA 함유 바이러스를하거나 RNA 함유를 연구하는 데 사용되는 현재 도서관 건설 프로토콜 nontargeted 템플릿 10을 제거하기 위해 초기 nuclease 치료를 필요로합니다. 그러나, 바이러스 지역 사회와 바이러스의 다양성의 집단 유전자 보완의 포괄적인 이해 관계 게놈 구성의 모든 구성원에 대한 지식이 필요합니다. 핵산 subtypes을 정화의 분류는 지역 사회의 유전자 서명의 일부를 희생하지 않고도 바이러스 assemblages을 연구하는 효과적인 메커니즘을 제공합니다. 히드록 시아파 타이트, 인산 칼슘의 결정 형태는 1960 년대 11 일 이후, 핵산의 분리뿐만 아니라 단백질과 미생물에서 채용되었습니다. 긍정적 - 충전 칼슘 2 사이 충전 상호 작용을 이용하여 + 히드록 시아파 타이트와 핵산 subtypes의 부정 청구 인산염 백본의 이온은, 그것이 우선적으로 다른 독립적인 각각의 핵산 subtype을 elute 수 있습니다. 우리는 최근에 DNA 시퀀싱 12 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA 함유 바이러스 독립적으로 분류 genomes이 전략을 고용. 여기, 우리는 히드록 시아파 타이트 chromotography를 사용하여 혼합 바이러스 assemblages에서 ssDNA, dsDNA와 RNA 바이러스 핵산의 분류 및 복구를위한 방법을 제시한다.

우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

바이러스, 특히 박테리오파지(파지)는 지구상에서 가장 수가 많은 생물학적 개체입니다1,2. 바이러스는 숙주 세포의 풍부도와 다양성을 조절하며, ...

이 영상은 핵산 조성에 기반하여 혼합 바이러스 군집을 분리하는 절차를 보여줍니다. 이를 통해 복잡한 바이러스 군집의 분류학적 다양성과 기능적 잠재력을 연구할 수 있습니다. 여기서는 인산 칼슘의 결정 형태인 하이드록시아파타이트가 핵산 분리에 사용됩니다.먼저, Hydroxyapatite 컬럼을 충전하고 평형화한 후 정제된 바이러스 핵산을 컬럼에 적용합니다. Hydroxyapatite의 양전하를 띤 칼슘 이온과 핵산 아형의 음전하를 띤 인산 골격 사이의 전하 상호작용을 통해 핵산이 컬럼에 결합됩니다. 다음으로 단일 가닥 DNA/RNA 및 이중 가닥 DNA를 서로 다른 농도의 인산염 완충액으로 순차적으로 용리합니다. 이렇게 얻은 핵산은 탈염 및 농축 과정을 거쳐 시각화, 정량화 및 DNA 시퀀싱을 통한 식별 준비를 합니다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 핵산 종이 9% 미만의 carryover로 분리될 수 있음을 확인합니다.따라서 이 방법을 통해 바이러스 군집의 다양성과 기능적 용량을 평가할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 j Craig Venture Institute의 Shannon Williamson 박사 연구실 연구원으로 근무하고 있는 Doug Fro입니다. 오늘은 환경 바이러스 어셈블리지에서 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 RNA를 분리하는 절차를 보여드리겠습니다.이 방법은 DNA 또는 RNA를 대상으로 하는 핵 처리와 같은 기존 방법보다 장점이 있습니다. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피는 전체 바이러스 군집을 포집할 수 있는 능력이 있습니다. 이 방법을 통해 바이러스 생태학 분야의 여러 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.예를 들어, 전체 유전자 보충물이나 바이러스 커뮤니티의 다양성은 어느 정도일까요? 저희는 유전적 특징의 일부를 희생시키지 않고 체사피크만(Chesapeake Bay)의 전체 리오 플랑크톤(Rio Plankton) 군집을 연구하고자 했을 때 처음으로 이 방법을 생각했습니다. 이 실험에 필요한 용액들은 함께 제공된 서면 프로토콜의 지침에 따라 미리 준비해야 하며, 여기에는 0.12 molar 인산염 완충액, 0.20 molar 인산염 완충액, 0.40 molar 인산염 완충액 및 1 molar 인산염 용액이 포함됩니다.pH 6.8 및 수화된 하이드록시아파타이트(hydrated hydroxyapatite) 조건 하에, 실험 당일 모든 인산염 완충액과 수화된 하이드록시아파타이트를 60°C 항온 수조에 넣어 평형을 맞춥니다. 바이러스 핵산을 분리하는 데 사용할 econo 컬럼을 준비함으로써 이 절차를 시작합니다. econo 컬럼 끝에 스톱콕(stopcock)을 부착하고 그것이 닫혀 있는지 확인하십시오.피펫을 사용하여 컬럼에 탈이온수를 넣은 다음, 컬럼 상단에 캡을 닫고 컬럼을 반복적으로 뒤집어 헹굽니다. 물을 따라내고 이 세척 과정을 여러 번 반복합니다. 그 다음, econ 컬럼에서 스톱콕을 분리하여 오토클레이브로 멸균합니다.스톱콕(stop cock)은 녹을 수 있으므로 오토클레이브 멸균을 하지 않습니다. 스톱콕을 이온수로 헹군 다음, 다시 70% ethanol로 헹구고 오토클레이브 멸균 후 공기 중에서 건조시킵니다. 스톱콕을 다시 장착하고 닫습니다.다음으로, 흄 후드 내에서 컬럼에 sigma coat 1 mL를 첨가하고, 여기에서 보여주는 것처럼 컬럼을 회전시키며 뒤집어 컬럼 유리를 코팅합니다. sigma coat로 코팅하면 핵산이 유리 표면에 흡착되는 것을 최소화할 수 있습니다. 분리 과정 동안, 일부 염 유리 표면이 코팅되었습니다.스톱콕을 열고 원뿔형 튜브에 옮겨 담습니다. 다음으로, 컬럼을 순환식 항온수조에 연결하기 위해 두 개의 클램프를 사용하여 컬럼을 링 스탠드에 고정합니다. 순환식 항온수조에서 실리콘 튜브를 연결하여, 수조에서 나오는 물이 아래에서 위로 흐르도록 합니다.온도를 60 °C로 설정하고 순환을 시작합니다. 실제 실험에서는 열 손실을 최소화하기 위해 컬럼과 튜브를 알루미늄 호일이나 폼 파이프 단열재와 같은 단열제로 감싸지만, 이 단계는 여기에서 생략되었습니다.절차를 더 잘 시각화하기 위해 스톱콕(stop cock)을 닫으십시오. 피펫을 사용하여 멸균된 RNase-free water 10 milliliters를 첨가합니다. 스톱콕을 열어 물을 배출시키십시오.그 다음 두 번째 세척 단계에 따라 다시 세척합니다. 10 mL의 멸균된 RNase-free 0.12 M 인산염 완충액으로 두 번 헹구고, 세척 단계 사이에 액체를 따라내어 제거합니다. 이제 컬럼이 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 위한 준비가 되었습니다.econ 컬럼의 스톱콕이 닫혀 있는지 확인하십시오. 그런 다음 멸균된 2 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 준비된 재현탁된 재수화 하이드록시아파타이트 2 mL를 컬럼 바닥에 천천히 첨가하십시오. 컬럼 캡을 다시 닫으십시오.하이드록시아파타이트가 중력에 의해 30분 동안 가라앉도록 둡니다. 이 방법은 세부 사항에 주의를 기울여야 합니다. 하이드록시아파타이트 컬럼은 분당 0.25에서 0.5 mL의 속도로 처리됩니다.따라서 컬럼이 마르지 않도록 세심히 관찰하는 것이 매우 중요합니다. 30분이 지나면 스톱콕을 열어 버퍼를 폐기물 용기에 배출하십시오. 스톱콕을 닫고 통과액을 폐기하십시오.핵산을 0.12 M 인산 완충액과 혼합하여 최종 부피 500 µL로 맞춘 후, 60 °C에서 10분 동안 배양합니다. 이렇게 하면 핵산이 컬럼의 온도와 평형을 이루게 되며, 존재할 수 있는 2차 구조를 제거함으로써 서로 다른 핵산 종의 분리 효율을 높일 수 있습니다. 2 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 컬럼을 흔들지 않도록 주의하며 핵산 용액을 하이드록시아파타이트에 빠르게 도포합니다.500 µL 전체가 컬럼으로 흐르면, 컬럼이 마르는 것을 방지하기 위해 0.12 M 인산염 완충액을 컬럼 상단에 소량 추가할 수 있습니다. 핵산이 하이드록시아파타이트에 결합할 수 있도록 30분 동안 둡니다. 결합 배양 후, 컬럼 아래에 15 mL 원추형 튜브를 배치합니다.그런 다음 스톱콕(stop cock)을 열고 단일 가닥 DNA가 포함된 초기 500 µL 샘플을 수집합니다. 500 µL가 수집되면 스톱콕을 닫습니다. 다음으로, 컬럼이 흔들리지 않도록 주의하면서 하이드록시아파타이트(hydroxy appetite)에 0.12 M 인산 완충액 6 mL를 첨가합니다.그 다음 스톱콕을 열고 이전 단계에서 사용한 동일한 15 milliliter 튜브에 단일 가닥 DNA가 포함된 통과액을 계속 수집합니다. 약 6 milliliter가 수집되면 스톱콕을 닫습니다. 튜브에 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 용액을 동일한 부피만큼 첨가하고 볼텍싱으로 세게 혼합한 다음, 3,500 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 튜브에는 두 개의 층이 형성됩니다. 단일 가닥 DNA가 포함된 상층액 층을 새로운 15 mL 튜브로 옮기고, 상온에서 보관하십시오. 컬럼에서 RNA를 용출하고 정제하려면 0.20 M 인산염 완충액 6 mL를 첨가하고, 새로운 15 mL 튜브를 사용하기 전에 통과액을 수집하십시오. 그 후 페놀-클로로포름 추출을 수행합니다.단일 가닥 DNA 샘플의 경우, 0.40 M 인산염 완충액 6 mL를 사용하여 컬럼에서 이중 가닥 DNA를 용출 및 정제하는 과정을 반복합니다. 마지막으로, 컬럼에 남아 있는 잔류 이중 가닥 DNA를 완전히 제거하기 위해 이 과정을 한 번 더 반복합니다.이번에는 1.00 M 인산염 완충액 6 mL를 사용하여 핵산 샘플을 탈염합니다. 각 샘플 4~5 mL를 30,000 분자량 컷오프 초여과 세포막이 장착된 Ultra-4 원심분리 필터 장치로 옮깁니다. 고정각 로터를 사용하여 30 °C에서 6,000 xg로 약 5분 동안 원심분리하여 샘플을 500 µL 미만으로 농축합니다. 여과액을 버린 후, 남은 샘플을 필터에 추가합니다.RNase-free 1X TE buffer를 사용하여 부피를 4~5 mL까지 맞춥니다. 그다음 농축된 부피가 될 때까지 다시 원심분리합니다. 원심분리 후 약 5분이 지나면, 필터에 RNase-free 1X TE buffer 4~5 mL를 추가하여 농축합니다.핵산 샘플의 염을 완전히 제거하기 위해 이 세척 과정을 추가로 5회 더 반복합니다. 샘플이 완전히 농축되고 탈염되면, 남은 핵산 샘플을 멸균된 1.7 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 부피의 1/10에 해당하는 sodium acetate, 2배 부피의 100% ethanol 및 1 microliter의 glyco blue를 첨가하고 볼텍싱으로 잘 혼합한 후 원심분리하여 핵산을 침전시킵니다.4°C에서 28,000 xg로 60분 동안 원심분리합니다. 이때 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.300 µL의 70% ethanol을 첨가하고 실온에서 28,000 g로 10분간 원심 분리합니다. 완전히 말리지 않은 상태에서 각 분획을 적절한 부피의 RNase-free TE buffer에 재현탁합니다. 바이러스 핵산인 M13 MP18 단일 가닥 DNA, MS2 단일 가닥 RNA, F-specific 이중 가닥 RNA 및 lambda 이중 가닥 DNA를 동일한 농도로 혼합한 후, 본 비디오에서 보여주는 것과 같이 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 분리하였습니다. 레인 6에 표시된 것과 같이 동일한 농도의 M13 MP18 단일 가닥 DNA, MS2 단일 가닥 RNA, F-specific 이중 가닥 RNA 및 lambda 이중 가닥 DNA를 혼합하여 여기 보이는 하이드록시아파타이트 컬럼에 로딩하였습니다.단일 가닥 DNA/RNA와 이중 가닥 DNA를 0.12 M, 0.18 M, 0.40 M 및 1.00 M 인산염 완충액을 사용하여 하이드록시아파타이트 컬럼에서 독립적으로 용리하였습니다. 게놈 크기를 확인하기 위해 1 KB ladder를 사용하였습니다. 이러한 결과는 이 방법이 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 RNA를 성공적으로 분리할 수 있으며, 인접한 분획 간의 전이(carryover)가 9% 미만임을 나타냅니다.이 방법은 여기서 보여주는 것과 같이 체사피크만(Chesapeake Bay) 내 바이러스 군집에서 분리한 핵산을 분리하는 데에도 사용되었습니다. 단일 가닥 DNA-RNA와 이중 가닥 DNA는 각각 0.12 M, 0.20 M, 0.40 M 또는 1.00 M의 인산 버퍼 농도를 사용하여 독립적으로 용출되었습니다. 여기서 볼 수 있듯이, 핵산의 대략적인 분자량과 질량을 시각적으로 확인하기 위해 1번 레인에는 high mass DNA ladder를, 2번 레인에는 1 KB ladder를 사용하였으며, 이중 가닥 DNA가 체사피크만 바이러스 플랑크톤에서 추출된 주요 핵산 유형이었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 이용하여 혼합 바이러스 군집으로부터 핵산을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.여기에는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite) 컬럼 및 핵산의 준비, 다양한 농도의 인산염 완충액을 이용한 핵산의 분리 및 용출과 탈염, 그리고 분리 후 핵산의 농축 과정이 포함됩니다.

separation-single-stranded-dna-double-stranded-dna-rna-from-an

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 정화를 위해 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 다음 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출을위한 방법을 설명합니다.

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

우리는 hypersaline 미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA를 추출하기위한 개선된 프로토콜을 제공합니다. 미생물 세포는 DNA 추출 및 정화하기 전에 매트 매트릭스에서 분리됩니다. 이것은 농도, 품질 및 DNA의 크기를 향상시킵니다. 프로토콜은 다른 내화물 샘플에 사용할 수 있습니다.

미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출

Isotachophoresis (ITP)는 독소 검출에서 샘플 준비에 이르기까지 다양한 애플 리케이션과 강력한 계면 분리 및 preconcentration 기술입니다. 분리와 작은 분자 및 세포 배양 lysate로부터 핵산 정화의 검출 : 우리는 ITP의 물리적 원리와 두 구체적인 예를 들어 응용 프로그램에이 기법을 적용하는 방법론을 검토합니다.

이온의 분리 및 핵산의 정화를위한 온칩 Isotachophoresis

단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

여기에서는 외딴 해양 환경에서 유기 및 무기 영양소 가용성과 미생물 및 바이러스 군집의 풍부함 및 구조를 평가하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

여기에서는 일본뇌염 바이러스의 양성 가닥 게놈 RNA의 전체 길이 cDNA를 포함하는 감염성 박테리아 인공 염색체를 만들기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 양성 가닥 RNA 바이러스의 기능적 cDNA를 구성하는 데 사용할 수 있어 바이러스 생물학 연구를 위한 강력한 게놈 도구입니다.

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 농도는 주로 바이러스의 식별 및 정량화를 위해 수행되는 어려운 작업입니다. 여러 바이러스 농축 방법이 개발되고 테스트되었지만, 여기서는 다양한 샘플 유형을 가진 RNA 바이러스에 대한 한외여과 및 탈지유 응집의 효과를 입증합니다.

탈지유 응집 및 한외여과를 사용한 환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 입자 농도

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 추출을 가속화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 표준 스윙 버킷 플레이트 로터와 호환되는 맞춤형 3D 프린팅 랙을 활용함으로써, 연구자들은 캡이 있는 최대 48개의 스핀 컬럼 또는 캡 없이 최대 116개의 스핀 컬럼을 동시에 처리할 수 있어 수동 마이크로 원심분리기 방식에 비해 취급 시간을 크게 줄일 수 있습니다.

24웰 랙을 이용한 중간 처리량 컬럼 DNA 추출

배우세요 히드록시아파이트 크로마토그래피를 사용하여 환경 바이러스 커뮤니티에서 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA 및 RNA를 분리하는 방법을 배우세요. 이 기술은 바이러스 다양성 연구에 활용됩니다.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

더 많은 동영상 탐색