Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

동결 골절된 쥐 뇌 조직 표본을 완충액에 넣으십시오.

시편은 표면 세부 사항을 향상시키기 위해 백금으로 코팅되고 구조적 안정성을 위해 탄소로 코팅됩니다.

세제가 포함된 소화 완충액이 있는 바이알에 검체를 옮깁니다.

조직 분해를 촉진하기 위해 배양하고 코팅에 내장된 막과 단백질을 그대로 둡니다.

잔해물을 제거하기 위해 버퍼로 세척하십시오.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 용액을 추가합니다.

표적 신경막 단백질에 특이적인 1차 항체를 도입합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

1차 항체에 결합하는 금 접합 2차 항체와 함께 배양합니다.

과도한 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

현미경 검사 중 염분 잔여물로 인한 인공물을 방지하기 위해 물로 헹굽니다.

투과 전자 현미경 또는 TEM 그리드에 표본을 장착합니다.

TEM 아래에서 검은색 점으로 나타나는 금 입자로 식별되는 표적 신경 막 단백질을 시각화합니다.

SDS 분해의 경우, 복제본을 1밀리리터의 SDS 분해 완충액으로 채워진 4밀리리터 유리 바이알로 옮깁니다. 섭씨 80도에서 흔들면서 18시간 동안 소화시킵니다. 면역 표지를 위해 복제본을 신선한 SDS-분해 완충액에서 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 섭씨 15도의 습한 챔버에서 2% BSA TBS로 희석된 1차 및 2차 항체와 함께 24 내지 72시간 동안 배양합니다.

그런 다음 formvar 코팅된 100줄 평행 막대 그리드에 복제본을 장착합니다. 80 또는 100킬로볼트에서 투과 전자 현미경으로 복제본을 이미지화합니다. 그런 다음 CCD 카메라를 통해 디지털 이미지를 획득합니다.