HO - Endonuclease의 형성의 Quantitation과 분석에서 어닐링 단일 스트랜드에 의해 염색체 Translocations을 자극 Saccharomyces cerevisiae

이 절차의 전반적인 목표는 이배체 발아 효모 세포에서 단일 가닥 무릎 꿇기에 의한 전좌 형성의 유전적 제어를 결정하는 것입니다. 이것은 먼저 특정 유전자형의 단일 군체를 배양액에 접종하고 하룻밤 동안 성장시킴으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 배양액에 갈락토스를 첨가하여 두 개의 염색체에 호 엔도뉴클레아제에 의한 동시 이중 가닥 절단 형성을 유도하는 것입니다.

다음으로 이러한 배양물의 희석액을 선택적 및 비선택성 배지에 도금합니다. 마지막 단계는 선택적 및 비선택적 배지에서 발생하는 콜로니를 계수하여 전좌 빈도를 결정하는 것입니다. 궁극적으로, 다른 유전자형의 균주에서 호에 의한 자극된 전좌 형성의 빈도 변화를 통해 무릎을 꿇는 단일 가닥에 의한 전좌 형성의 유전적 제어를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술의 의미는 DNA 이중 가닥 절단과 전좌 형성이 이 치료 치료의 주요 결과이기 때문에 암 환자의 치료적 방사선 노출의 결과로 확장됩니다. ho 자극 전좌 빈도를 결정하는 절차를 시작하려면 10-20개의 독립적인 1밀리리터 배양액의 Y 피크 글리세롤 락테이트 배지에 원하는 유전자형의 단일 콜로니를 접종하고 배양액을 회전체에서 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 배양물이 원하는 세포 밀도에 도달하면 배양물에 20%갈락토오스를 추가하여 최종 농도 2%갈락토스를 첨가하면 3번 염색체의 히스토리 델타 5 프림 대립유전자에서 이중 가닥 절단을 지시하고 15번 염색체의 3 델타 3 프림 대립유전자가 회전체에서 섭씨 30도에서 4시간 동안 배양하는 호 엔도뉴클레아제의 발현을 유도합니다.

다음 단계는 절차의 성공에 매우 중요합니다. 배양물을 신중하게 희석하고 도금하는 것이 필수적입니다. 서로 다른 유전자형의 균주를 통계적으로 유의미하게 비교할 수 있을 만큼 충분히 재현 가능한 전좌 빈도를 얻으려면, 4시간 플레이트에서 히스티딘이 결핍된 배지와 YPD td로 배양물을 적절하게 희석한 후 플레이트당 약 100-200개의 콜로니를 2-3일 동안 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다.

군체가 발생하면 전위 빈도를 결정할 수 있습니다. ho endonuclease 발현 유도 전후의 도금 효율은 전좌 염색체의 유무가 DSB 형성에서 생존하는 능력에 영향을 미치는지 여부를 나타냅니다. 이는 염색체 3번과 염색체 15번 모두의 사본 하나를 단편화하여 유도 전 도금 효율을 결정합니다.

먼저, 각 야간 배양에서 세포 분취량을 제거하고 혈류 세포 분석기로 계수하여 세포 수를 측정합니다. 다음으로, 적절한 희석액을 사용하여 약 100-200개의 세포를 YPD 인큐베이트에 플레이트화하여 콜로니가 생길 때까지 섭씨 30도에서 2-3일 동안 배양합니다. 나머지 배양액에 20%갈락토스를 첨가하여 최종 농도 2%를 달성하고 섭씨 30도에서 4시간 동안 배양하여 유도 도금 후 효율을 측정합니다.

유도 4시간 후 각 배양액에서 세포 분취액을 제거하고 혈세포 분석기로 세포 수를 측정합니다: YPD에 적절한 희석액을 사용하여 약 100-200개의 세포를 계산하고 집락이 생길 때까지 섭씨 30도에서 2-3일 동안 배양합니다. 플레이트에 콜로니가 발생하면 도금 효율을 결정할 수 있습니다. 추정되는 전좌 베어링 클론은 서던 블롯(southern blot)으로 검사할 수 있습니다.

이 절차는 각 독립적인 시험에서 단일 히스와 재조합 콜로니로 준비된 게놈 DNA를 사용하여 BAM H 1개의 제한 엔도뉴클레아제로 각 DNA 샘플을 약 4마이크로그램 분해한 다음 0.7%aros에서 별도의 BAM H 단편을 분해한 다음 1.8 킬로베이스 BMH 1개의 BMH 1개의 게놈 클론으로 무작위 프라이밍하여 얻은 P 32 표지 프로브와 혼성화된 양전하를 띤 나일론 멤브레인으로 이동합니다. 3 유전자. 자동 방사선 촬영 또는 포스포 이미징으로 DNA 단편을 시각화할 수 있습니다. 추정되는 전좌 베어링 클론을 조사하는 또 다른 방법은 염색체 플롯 분석을 사용하는 것입니다.

염색체는 먼저 선택된 히스와 aros의 재조합 물질, aros 플러그, 윤곽선, 클램핑 된 균질 전기장 또는 섭씨 14 도의 요리사에서 1 % aros 젤에 별도의 염색체를 준비합니다. 다음 매개 변수는 첫 번째 블록이 섭씨 14도, 72 번째 스위치 시간 및 6 볼트 센티미터에서 15 시간, 두 번째 블록, 섭씨 14도, 122 번째 스위치 시간 및 6 볼트에서 11 시간이 사용됩니다. 전기영동이 완료되면 겔을 AUM 브로마이드로 30분 동안 염색한 다음 UV를 조사하고 모세관 작용에 의해 염색체를 억류 및 증류수로 양전하를 띤 멤브레인으로 전달하여 염색

변성 조건은 1.8 킬로베이스 bam H, 1 bam H, 1 게놈 클론을 포함하는 1.8 킬로베이스 bam H, 하나의 게놈 클론으로 무작위 프라이밍하여 얻은 P 32 표지 프로브와 혼성화됩니다. 3개의 유전자는 자동 방사선 촬영 또는 phospho imaging에 의하여 염색체를 시각화합니다. 염색체 전좌의 빈도는 히스타민 광영양 집락의 수를 YPD에 도금하여 결정된 생존 가능한 세포의 총 수로 나누어 계산할 수 있습니다.

이 예에서 계산된 재조합 빈도는 약 3%입니다.ho 자극 전좌 빈도에 대한 분석은 단일 가닥에 의한 이중 가닥 절단을 복구하는 능력의 차이를 비교하기 위해 서로 다른 유전자형의 균주를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 대표 그래프에서 볼 수 있듯이 무릎을 꿇고 있습니다. RAD 51 델타 null 동형접합체로 선택적으로 및 비선택적으로 얻어진 전좌 빈도는 유도 도금 전후 야생형 균주와 함께 해당 조건을 사용하여 얻은 것과 통계적으로 달랐습니다.

효율성은 생존 가능한 집락 형성 세포의 총 수를 이 표와 같이 유도 도금 전후에 표시된 바와 같이 혈구 분석기 수에 의해 결정된 배양 내 세포체의 총 수로 나누어 결정됩니다. 효율성은 야생형 세포에 대해 크게 다르지 않았으며, 이는 전좌 염색체의 유무가 생존 능력에 영향을 미치지 않음을 시사합니다. DSB 형성.

추정되는 전좌 베어링 클론은 게놈 서던 블롯 분석으로 검사할 수 있습니다. 전좌 형성 전후의 관련 염색체를 그래픽으로 표현한 것이 여기에 나와 있습니다. 모 및 재조합 균주로부터 게놈 DNA의 BAM H one 분해에 의해 생성되고 1.8 kilobase BAM H 균주와의 혼성화에 의해 블롯에서 밝혀진 관련 서열을 포함하는 제한 단편의 크기.

그의 3개의 게놈 클론은 서던 블롯 분석을 위해 킬로베이스 쌍으로 나열됩니다. 게놈 DNA는 BMH 1 엔도뉴클레아제로 절단되고 1.8 킬로베이스로 표지된 P 32에 혼성화됩니다. 이러한 진단 단편을 시각화하기 위한 HIS 3개의 프로브.

0.8 킬로 베이스, HIS 3 델타 201.7 킬로 베이스 히스 3 델타 3 프라임 4 킬로 베이스 T 3 15 5 킬로 베이스 T 15 3 및 8 킬로 베이스 히스 3 델타 5 프라임 조각. 레인 A는 상위 이배체입니다. 레인 B는 히스 플러스 비역 전좌 재조합이고 레인 C는 his 플러스 상호 전좌입니다.

재조합 염색체 BLO 분석을 사용하여 전좌 베어링 클론을 검사할 수도 있습니다. aros 플러그에서 준비된 온전한 염색체는 셰프 전기영동과 젤에 의해 분리되고 이리듐 브로마이드로 염색되고 자외선 아래에서 시각화됩니다. 그런 다음 분리된 염색체를 나일론으로 블롯팅하고 1.8 킬로베이스로 표시된 P 32와 혼성화합니다.

1.1 메가베이스 온전한 염색체, 15.8 메가베이스 T, 15 메가베이스, 3 개의 전좌 염색체, 0.6 메가베이스 T, 3 개의 15 전좌 염색체 및 0.3 메가베이스 손상되지 않은 염색체 3 개를 시각화하는 그의 프로브. 레인 A는 배포된 상위 항목입니다. 레인 B는 A에 더한 비역수 전좌 재조합이고, 레인 C는 그의 플러스 상호 전좌 재조합입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 여러 HO 자극 이중 가닥 절단 후 전좌 형성 빈도를 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.