Name: HO - Endonuclease의 형성의 Quantitation과 분석에서 어닐링 단일 스트랜드에 의해 염색체 Translocations을 자극 Saccharomyces cerevisiae /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 HO 엔도뉴클레아제를 이용한 이중가닥 절단 유도 및 단일가닥 어닐링을 통한 Saccharomyces cerevisiae 염색체 전좌 형성의 유전적 조절 메커니즘 분석 방법. 이 기법은 방사선 치료 후 유전체 안정성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 건강과 희망의 도시의 베크 만 연구소의 국립 연구소의 자금에 의해 지원되었다. 우리는 원고에 투명도를 추가들은 건설 덧글에 대한 검토를 감사하고 싶습니다.

1. 호 - 자극 translocation 주파수 <ol><li> 원하는 유전자형의 한 식민지와 YPGly / LAC 매체 (1 % 효모 추출물, 펩톤 2 %, 3 % 글리세롤과 3 % 젖산)의 10-20 독립적인 하나 ML 문화의 예방. ° C 회전, 또는 ​​부드러운 교반 30에서 약 5x10 1x10 7 8 셀 / ML의 세포 밀도에 도달하는 데 충분한 시간을 하룻밤, 또는 문화를 품다. </li><li> his3 - Δ3 '(염색체 III)와 his3 - Δ5'(염색체 XV) translocation 기판에 호 endonuclease - 감독 DSBs를 유도하기 위해 2 %의 최종 농도 문화 갈락토 오스를 ​​추가합니다. </li><li> 30 4 H에 대한 품어 ° C 회전, 또는 부드러운 선동과 함께. </li><li> 네 후 H, YPD에 문화 (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 %의 덱스 트로 오스)의 플레이트 적절한 dilutions는 관찰할 수를 얻을 수 약 100-200 판 당 식민지, 그리고 세포의 충분한 수의 중간 부족한 히스티딘로를 양보하기 위해 그의 + 재조합 식민지의 개수. 30 접시를 품어 ° C 2-3일하십시오. </li></ol> 참고 : 단계 1.4 중간 부족한 히스티딘에 문화를 도금하여 선택적 조건 하에서 translocation 주파수의 결정에 대해 설명합니다. 이 분석은 또한 2-3일 나중에 접시 - 그의에 발생하는 식민지가 복제 - 도금 후 YPD에 문화를 도금하여 비 선택적 조건에서 실시하고 있습니다. 이러한 방법은 translocation 비슷한 주파수 (그림 2C)을 생산하고 있습니다. <ol start="5"><li> 도금 가능한 세포의 총 개수 (YPD에 도금 dilutions에 의해 결정)에 의해 히스티딘 prototrophic 식민지의 수를 나누어 translocation 주파수를 확인합니다. 중간 translocation 주파수와 95 % 신뢰 구간 15 결정합니다. </li></ol> 2. 도금 효율성 <ol><li> 각 숙박 문화의 세포의 나누어지는를 제거하고, hemacytometer 카운트 (박스터 헬스케어 공사 Catolog #. : B3178 - 1)에서 휴대폰 번호를 확인합니다. </li><li> 플레이트 약 100 YPD에 적절한 희석을 사용하여 200 세포 수 있습니다. 30 두 3 일 동안 품어 ° C (예 : 1x10 8 셀 / ML의 세포 밀도와 문화, 한 판해야 접시 당 10-5 희석의 100-200 μl). </li><li> 2 %의 최종 농도 문화 20 % 갈락토 오스를 추가합니다. </li><li> 4 H 후, 각 문화의 세포의 나누어지는를 제거 hemacytometer 카운트하여 휴대폰 번호를 결정하고, YPD에 적절한 희석을 사용하여 번호판 약 100-200 세포. 30 두 3 일 동안 품어 ° C. </li><li> 도금 세포의 숫자로 YPD에 게재하고, 100이 지수를 곱한 콜로니의 수를 나누어 도금 효율을 확인합니다. 95 % 신뢰 구간으로 평균 비율을 결정합니다. </li></ol> 3. 게놈 남부 얼룩 분석 <ol><li> 각각의 독립적인 재판으로부터 하나의 그의 + 재조합 식민지를 선택하고 게놈 DNA에게 16 준비. </li><li> BamHI 제한 endonuclease와 함께 DNA의 약 4 μg을 소화. </li><li> 별도의 BamHI은 0.7 % 아가로 오스 겔에 조각을 소화하고, 긍정적 - 충전 나일론 막 (Hybond N +, GE 헬스케어 제품 코드. : RPN303B)로 전송 17. </li><li> HIS3 유전자를 포함하는 1.8 킬로바이트 BamHI / BamHI 게놈 클론과 함께 : 임의의 프라이밍 (RPN1604. Amersham Biosciences 제품 코드)에 의해 얻은 32 P - 라벨 프로브와 함께 잡종. </li><li> autoradiography 또는 phosphorimaging로의 DNA 조각을 시각화. </li></ol> 4. 에서 분리된 염색체를 사용하여 염색체 얼룩 분석 윤곽 - 고정되어 균일한 전기장 (요리사) : <ol><li> 아가로 오스 플러그 18 선택된 그의 이상 recombinants에서 염색체 준비 : <ul><li> 그의 + 후보 tXV의 액체 문화를 성장 : III 약 1-2 x를 YPD 5 ML에서 재조합 염색체 함유 10 8 셀 / ML. </li><li> 다운 스핀 50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 세포에게 2 번 씻는다. </li><li> Resuspend 50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 약 200 μl의 세포, 그리고 50 따뜻한 ° C. </li><li> 낮은 용융 아가로 오스는 50 ° C, 철저하게 믹스를 가져온이 용융 %의 동일한 부피 (W / V)를 추가합니다. </li><li> 플러그 금형에 약 80 μl aliquots을 분배하고, 그들 4 30 분 시원한 수 있습니다 ° C. </li><li> 압출 성형은 12 잘 요리로 금형에서 플러그. 최대 5 플러그에 각 우물에 삽입할 수 있습니다. </li><li> 각 잘하는 신선한 spheroplasting 솔루션 3 ML (2 - β - 메르 캅 토 에탄올 14 MM 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.5 MG / ML Zymolyase 20T, 10 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5, 1 M Sorbitol) 추가합니다. ° C 4 시간 동안은 부드러운 교반과 함께 37 알을 품다. </li><li> spheroplasting 솔루션을 제거하고 신분증 솔루션 (3 ML로 교체 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % (W / V) 리튬 Dodecyl 황산, adjus8.0 t의 산도). 37 ° C 부드러운 교반과 함께 15 분 알을 품다. </li><li> 신분증 솔루션을 제거하고 신분증의 다른 세 ML의 나누어지는로 바꿉니다. 부드러운 교반과 함께 ° C 하루 37 알을 품다. </li><li> 신분증을 제거하고 0.2 X NDS (0.6 g 트리스베이스, 93g 나트륨 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 이수화물, 5g N - Lauroyl Sarcosine, 8.0 산도를 조정, DH 2 O 500 ML로 이동) 3 ML로 바꿉니다. 부드러운 교반 30 분 실온에서 알을 품다. NDS를 제거하고, 2 번 반복합니다. </li><li> NDS를 제거 및 3 ML TE로 바꿉니다. 상온에서 30 분 부드러운 교반과 함께 씻으십시오. 4 번 반복합니다. </li><li> 저장소가 4 플러그 ° C TE 2 ML 인치 플러그는 일년까지 유지할​​ 수 있습니다. </li></ul></li><li> 14에서 바이오 - RAD 요리사 - DRII 장치를 사용하여 1 % 아가로 오스 겔에 별도의 염색체 ° C (카탈로그 # : 170-3612). </li></ol> 매개 변수 : 1 일 블록 : 70 년대 스위치 시간 6V/cm에서 15h. 2 차 차단 : 120s 스위치 시간 6V/cm에서 11h <ol start="3"><li> UV Stratalinker (Stratagene)에 자외선 60 MJ와 irradiating 30 분 1μg/ml ethidium의 브로마이드와 얼룩에 의한 염색체를 시각화하고, DH 2 O를 30 분 드 염색법 멤브레인에 효율적으로 전송할 수 있도록 ethidium의 브로마이드 자국 염색체 닉스에게 DNA를 Irradiating. </li><li> denaturing 조건에서 모세관 작용 (0.4N NaOH, 1.5M NaCl)에 의해 : 긍정 청구 멤브레인 (RPN303B. Hybond N +, GE 헬스케어 제품 코드)로 염색체를 전송합니다. </li><li> HIS3 유전자 17 포함 1.8 킬로바이트 BamHI / BamHI 게놈의 복제와 함께 : 임의의 프라이밍 (RPN1604. Amersham Biosciences 제품 코드)에 의해 얻은 32 P - 라벨 프로브와 함께 잡종. </li><li> autoradiography 또는 phosphorimaging하여 염색체를 시각화. </li></ol> 5. 대표 결과 : translocation 분석의 그래픽 표현은 염색체 수준 (그림 1)에 그려져 있습니다. 실험 절차의 구조도 (그림 2A)이 표시됩니다. 모두 사전 및 사후 유도 도금 효율성은 hemacytometer 카운트 (그림 4B)에 의해 결정 문화에 세포 기관의 총 숫자로 가능한, 콜로니 형성 세포의 총 숫자를 나눔으로써 결정됩니다. 사전 및 사후 유도 도금 효율성은 야생 형 전지 (P - 값 = 0.1400) (표 1) 크게 다르지 않아. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="표 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 표 1. 사전 및 야생 형 세포에서 포스트 유도 도금 효율성. 밀리리터 당 세포 기관의 숫자는 hemacytometer 개수에 따라 결정됩니다. B 밀리리터 당 가능한 세포의 숫자는 ~ 100-200 식민지를 생산하지 않는 선택적 중간에 적절한 dilutions를 도금에 의해 결정됩니다. C 사전 및 사후 유도 도금 효율성이의 총 숫자를 나눔으로써 결정됩니다 실용적, 식민지가 형성 hemacytometer 개수에 의해 결정 문화에 세포 기관의 총 숫자로 셀. 이것은 하나의 염색체 translocation의 존재 또는 부재가 DSB 형성 살아남을 수있는 능력에 영향을 미치지 않는 것이 좋습니다. 염색체 translocations의 빈도는 YPD에 도금 (그림 2B)에 의해 결정 가능한 세포의 총 숫자로 히스티딘 prototrophic 식민지의 수를 나누어 계산하실 수 있습니다. (- / - 예 rad51Δ)이 분석은 단백질 기능의 손실이 특수 요원 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해 서로 다른 유전자형의 변종을 사용하여 진행하실 수 있습니다. 다른 변종 결정 재조합 주파수는 다음 (그림 2C) 특수 요원으로 호 - endonuclease 유도 DSBs을 복구하려면 다음과 종자의 능력의 차이를 비교하는 그래프로 작성할 수 있습니다. translocation 주파수가 선택 얻은 동안 선택에 따라 야생 형 diploid 스트레인 (2.2x10 -2) 및 조건 (2.17x10 -2) 이외의 선택과 함께 얻은 Translocation 주파수는 (P - 값 = 0.9131) 서로 통계적으로 다르지 않아 (6.0x10 -2) 및 비 - 선택 (11.9x10 -2) rad51Δ과 함께 - / - homozygote는 비슷하지만 (P - 값 = 0.0089) 통계 달랐다. / - - 주파수 rad51 °로 선택 모두 (P - 값 = 0.0001) 및 비 - 선택 (P - 값 = 0.0002) 획득 homozygote는 야생 타입 변형으로 해당 조건을 사용하여 얻은 이들의 통계 달랐다. Putative translocation 베어링 클론은 더욱 게놈 남부 얼룩 및 염색체 얼룩 분석 (그림 3)에 의해 검사를하실 수 있습니다. 남부의 분석을 위해, 게놈 DNA는 32 blotting과 하이브 리다이 제이션, 사전 아가로 오스 겔 전기 영동에 BamHI endonuclease의와 소화조각 (그림 3B.1) 1.8kb HIS3 탐사선이 진단 0.8 킬로바이트 his3Δ200, 1.7 킬로바이트 his3 - Δ3 ': : : XV, 5킬로바이트 tXV : III, 그리고 8킬로바이트 his3 - Δ5, 4킬로바이트 때까지'을 시각화하기 위해 P - 라벨 . 그대로 염색체는 요리사 (그림 3B.2)로 구분하여 준비 나일론으로 blotted 및 32 hybridized 수있는 P - 라벨 1.8 킬로바이트 HIS3 탐사선이 1.1 MB 그대로 염색체 XV, 0.8 MB tXV 시각 : III의 translocation의 염색체, 0.6 MB의 얹혀 : XV의 translocation의 염색체, 그리고 0.3 MB 그대로 염색체 III (그림 3B.3). 그래픽지도 BamHI endonuclease - 소화가 게놈 DNA 조각, 그리고 부모와 재조합 염색체를 (그림 3A) 그려져 있습니다 예상 묘사. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 단일 스트랜드로 translocation 염색체의 형성은 (특수 요원) 어닐링. 1) DSBs가 문화 갈락토 오스의 또한 다음과 같은 his3 - Δ3 '와 his3 - Δ5'기판 (각각 염색체 XV 및 III) 호 endonuclease에 의해에서 만들어집니다. 2) DSBs은 깨진 염색체의 끝에 3 '단일 가닥을 생성하는 처리됩니다. 3) 특수 요원 기계 anneals 보완 311 또는 재조합 기판의 각에서 형성된 60 염기 단일 좌초 HIS3 시퀀스. 소둔시 형성이 아닌 동종 꼬리는 endonuclease의 소화에 의해 제거됩니다. HO - endonuclease의 소화에 의해 형성 나머지 염색체 조각을 보완 네 BP의 overhangs도 어닐링 수 있습니다. 특수 요원에 의해 III의 translocation의 염색체 : 4) 결합이 손상 HIS3 유전자와 tXV의 생성을 마칩니다. 이 염색체를 가지고 세포 중간 부족한 히스티딘의 성장 능력에 의해 선택하실 수 있습니다. : NHEJ 같은 메커니즘을 통해 XV의 translocation의 염색체 : 내고 또한 상호 때까지 생성할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 특수 요원으로 translocation의 빈도를 결정하는 분석.) 하나 ML YPGly / LAC 문화가 선택 유전자형의 세포 하나의 식민지로 주사하고 약 5x10 1x10 7 8 셀 / ML의 적절한 밀도로 성장하고 있습니다. 갈락토 오스는 염색체 III와 XV에 재조합 기판에 DSBs을 만드는 2 %의 최종 농도에 추가됩니다. 선택적 조건 하에서 분석을 실시하기 위해 적절한 dilutions는 약 100-200 세포 YPD에 도금하는 등 만들어집니다과 세포의 충분한 숫자는 그의 + 재조합 식민지의 관찰 번호를 양보하기 위해 중간 부족한 히스티딘에 도금입니다. 선택하지 않고 분석을 실시하기 위해 약 100-200 세포는 YPD에 도금 중간 부족한 히스티딘에 도금 하나의 식민지 후 복제에 2 ~ 3 일 동안 성장하고 있습니다. B) Translocation 주파수는 YPD에서 성장 분획하여 - 그의 접시 성장 식민지의 개수를 나눔으로써 결정하실 수 있습니다. C) 다른 유전자형 (예 야생 유형과 rad51Δ의 변종의 translocation 주파수는 - / -) 특수 요원으로 DSBs을 복구하려면 다음과 종자의 능력의 차이를 비교하는 그래프로 작성할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 도금의 효율성을 결정. (A) 세포의 나누어지는가 하룻밤 이전 문화와 이후 DSB 유도에서 가져온 것입니다, 해당 dilutions는 문화의 ML 당 세포 기관의 총 수를 결정하는 hemacytometer 카운트 뒤에, 만들 수 있습니다. 적절한 dilutions는 YPD에 나타나는 식민지를 세어, ML 당 실용적 세포의 총 수를 결정하기 위해 비 선택적 중간에 도금입니다. (B) 도금 효율 후 세포 기관의 총 숫자로 가능한 세포의 총 수를 나누어, 100으로이 지수를 곱하여 결정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 게놈 남부 얼룩 및 염색체 얼룩 분석에 의한 염색체 translocation 이벤트 감지. A) 그래픽 전에 관련 염색체의 표현 (왼쪽)와 (오른쪽) translocation 형성 후. 부모와 재조합 염색체의 크기는 megabase - 쌍 (MB)로 나열됩니다. 부모와 재조합 종자의 게놈 DNA의 BamHI는 소화 과정에 의해 생성된 관련 시퀀스를 포함하는 제한 조각의 크기, 그리고 1.8 킬로바이트 BamHI HIS3 게놈 복제와 이종 교잡에 의해 blots에 대한 공개는 kilobase - 쌍 (KB)로 나열됩니다. 염색체는 규모에 그려되지 않습니다. putative translocation 베어링 클론 B) 물리적 분석. (1) 게놈 남부 얼룩 분석 - 게놈 DNA가 겔 전기 영동, blo에 의해 fractionated, BamHI 제한 endonuclease로 수집하고 소화했습니다나일론 to tted, 다음과 같은 조각 시각화하는 32 P - 라벨 1.8 킬로바이트 HIS3 프로브 hybridized : 0.8 킬로바이트 his3Δ200, 1.7 킬로바이트 his3 - Δ3 '4킬로바이트 때까지 : XV, 5킬로바이트 tXV : III, 그리고 8킬로바이트를 his3 - Δ5. 레인 : 재조합) 부모 diploid, B) 그의 재조합 + 비 상호 translocation, C) 그의 + 상호 translocation. (2) 요리사 젤 - 손상 염색체는 ethidium의 브로마이드 물들일, 요리사로 구분하여, 아가로 오스 플러그의 준비와 자외선 아래에서 시각되었습니다. 레인 : 위에서. (3) 염색체 blots - 분리된 염색체는 나일론으로 blotted 다음과 같은 염색체 시각화하는 32 P - 라벨 1.8 킬로바이트 HIS3 프로브와 hybridized되었습니다 : 1.1 MB 그대로 염색체 XV, 0.8 MB tXV : III의 translocation의 염색체, 0.6 MB 때까지 : XV의 translocation을 염색체, 그리고 0.3 MB 그대로 염색체 III. 레인 : 위에서.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이온화 방사선의 다량으로 복용는 DSBs 19 다수의 생성을 통해 게놈 불안정성의 고유 위험을 제시한다. 진핵세포 genomes는 translocations 및 기타 게놈의 rearrangements 20,21 생성을 위해 우수한 기판 아르 반복 시퀀스들로 가득 차 있습니다. DSBs가 반복 시퀀스 12,21,22 사이에 도입하는 경우 인사에 의해 염색체 translocations이 자주 관찰됩니다. 압도적인 증거는이 메커니즘 eukaryotes 22,23에서 발생하는 방법 이해의 중요성을 강조, leukemias과 lymphomas 염색체 translocations에 의한 수와 관련된 게놈 불안정성의 정도를 제안합니다. 우리는 누룩과 인간의 genomes에 걸쳐 분산 반복 요소의 크기와 유사한 다른 염색체에있는 상동 부족 지역 간의 DSB 유발 HR로 translocation 염색체의 형성을 조사를 위해 신진 효모의 시스템을 개발했습니다. 분석에서 his3 - Δ3 &#39;translocation 기판은 염색체 XV 중 하나를 복사에 있습니다. 다른 his3 allele (his3 - Δ200)은 수리 24 템플릿으로 사용되는에서이 순서를 방지 HIS3 발기인 및 코딩 순서 ~ 1킬로바이트 삭제되었습니다. his3 - Δ5 &#39;기판 변형 LEU2 allele (그림 1)을 포함하는 염색체 III의 다른 사본, 염색체 III 중 하나를 복사에 LEU2 현장에 있습니다. KAN - MX로 표시 갈락토 - inducible 호 endonuclease 표현 카세트는 염색체 IV (: : GAL 호 - KAN - MX trp1)의 TRP1 현장에 삽입되었다. 각 translocation 기판은 매체 갈락토 오스의 추가를 통해 HO 유전자의 표현을 유도하여 절단을위한 타겟이 될 수있는 호 - endonuclease 인식 시퀀스의 어귀이다. his3 - Δ3 &#39;와 his3 - Δ5&#39;기판에서 HO - endonuclease 유도 절단 후, 세포가 효율적으로 translocation의 염색체를 생성, HR에 의해 깨진 염색체를 복구 HIS3 순서 상동의 공유 짧은 넓이 (311 BP 60 BP)를 사용할 수 있습니다 손상 HIS3 allele 12-14,25와 함께. 부모 세포 HIS3 유전자의 손상 사본이 부족하기 때문에, 그들은 중간 그의 - 어서 성장 수 없습니다. translocation 이벤트를받은 경우에만 세포는 중간 부족한 히스티딘에 대해 선택할 수 있습니다. 따라서 염색체 translocations의 빈도는 YPD에 도금에 의해 결정 도금 가능한 세포의 총 숫자로 히스티딘 prototrophic 식민지의 수를 나누어 계산하실 수 있습니다. 게놈 DNA와 염색체 손상은 다음 대표 그의 +의 식민지, 그리고 게놈 남부와 염색체 얼룩 분석에 의해 확인 translocation의 염색체의 존재로부터 격리 수 있습니다. 조심 분석 분석 12에 대한 추가 중요한 정보를 수집하는 우리를 허용하고 있습니다. 게놈 남부 얼룩 분석 호 - endonuclease 유도 30 분 후에 염색체 XV 및 III 거의 완벽하게 커팅이있다는 것을 증거를 제공하고 있으며, 따라서 포경 염색체 기판에 대한 중요한 배경은 (G. Manthey &amp; A Bailis, 인구 없습니다 게시되지 않은 결과). 그의 게놈 남부와 염색체 얼룩 분석 - 생존자는 세포가 자주 하나 다른, 또는 둘 모두를 자른 염색체를 잃게하고 (L. Liddell &amp; A Bailis, 발표되지 않은 결과) 가능한 남아있는 것을 나타냅니다. 중요한 것은 아닌 선택적 매체에 거의 동등한 도금 효율성은 HO - endonuclease 표현의 유도 이전과 이후 translocation 염색체를 유지하기 위해 깨진 염색체를 복구에 실패하거나 실패도가 DSB 형성 살아남을 수있는 능력에 영향을 미치는 것을 나타냅니다. 이걸로 일관 tXV : III의 translocation의 염색체가 선택의 부재에서 mitotic 세포의 불안정으로 표시되었습니다. 이것은 tXV 성장에 의해 입증되었습니다 : III가 아닌 선택 밤새 그의 이상 recombinants를 포함하지 않는 선택적 접시에 하나의 식민지를 도금하고, 히스티딘이 부족해 중간에 선택적 복제 도금. : III의 translocation의 염색체 (북아 일 Pannunzio &amp; A Bailis, 발표되지 않은 결과를) 다음 접시에 발생하는 식민지의 열 70 %가 tXV을 잃었습니다. 인간 IR 노출에 의해 생성된 Translocation 염색체는 비슷한 불안정 26 나타냅니다. 이것은 translocation 형성이 heterozygosity의 손실을 홍보하여​​ tumorigenesis 초기에 이벤트에 참여할 수 있습니다 제안합니다. 둘째, 광범위한 유전자와 분자 분석은 특수 요원, HR의 비 보수 obligatorily 효율적이고 메커니즘, 두 염색체 12,27,28에 DSBs의 동시 생성에 따라 HR하여 translocation 형성의 기본 메커니즘이다하는 것이 좋습니다. 이것은 공동입니다찾는 nsistent되는 HR하여 효모의 게놈에서 여러 반복적인 시퀀스에 인접한 휴식을 만들 수있는 충분한 DSBs의 밀도, 그리고 translocation 형성의 고주파로 IR 결과의 과다. 함께, 이러한 관측 것이 좋습니다 종양 인간 IR 노출 효과 수, 부분적으로 그들의 고유 불안정을 통해, 그 출시 tumorigenesis 유전자 변화를 추진, translocations를 생성하는 HR의 효율적인 메커니즘에 의해 DSBs의 수리로 인한. 방사는 종종 방사선 유발 DSBs 수리의 결과가 환자의 자주 발생하는 이차 암의 발생에 기여할 수있는 암, 게놈 rearrangements을 치료하는 데 사용되기 때문입니다. 따라서,이 모델은 우리가 IR 치료에 중요한 임상 응답의 유전 및 분자 기초에 대한 이해를 얻을 도움이 될 수 있습니다.

ho - endonuclease의 형성의 quantitation과 분석에서 어닐링 단일 스트랜드에 의해 염색체 translocations을 자극 saccharomyces cerevisiae</em

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

유전자 변이가 자주 모든 진핵세포 게놈에 존재 반복 요소를 분산 간의 상호 작용을 통해 발생하는 게놈 rearrangements에 의해 중재됩니다. 이 과정은 1-3 사이의 유기체 내의 다양성을 생성하는 중요한 메커니즘입니다. 인간 게놈은 라인과 SINEs 4 다양한 포함한 retrotransposon의 원산지의 약 40% 반복 순서로 이루어져 있습니다. 이러한 반복적인 요소 간의 교류 이벤트는 유전자 투약과 인간 6-9에서 면역, 심장 혈관 질병 5,뿐만 아니라 암이 발생할 수 표현을 중단 할 수 translocations를 포함한 게놈 rearrangements, 발생할 수 있습니다. 반복 요소 간의 교류 다양한 방법으로 발생합니다. 완벽한 (또는 가까운 완벽한) 상동를 공유 시퀀스 사이의 교류 과정 상동 재조합이라고 (HR)에 의해 발생합니다. 반대로, 이외의 동종 끝 (NHEJ) 가입이 교환 10,11 거의 또는 전혀 순서 상동를 사용하지 않습니다. HR의 주요 목적은, mitotic 세포에서 더블 스트랜드 탈선 DNA 복제와 산화 병변에 의해 endogenously 생성 휴식 (DSBs) 또는 이온화 방사선 (IR​​) 및 기타 외인성 DNA 손상 에이전트에 노출로를 복구하는 것입니다. 분석이 여기에 설명된에서 DSBs 동시에 갈락토 - inducible 호 - endonuclease (그림 1)에 의해 diploid 세포에 두 개의 서로 다른 염색체 loci에서 재조합 기판을 경계 만들어집니다. 깨진 염색체의 복구 (특수 요원) 어닐링 단일 가닥에 의해 염색체 translocations를 생성, 동종 염색체 종료에 인접한 시퀀스 과정은 covalently 어닐링에 후속 참가하고 있습니다. 기판 중 하나, his3 - Δ3는 HIS3 allele를 잘린 &#39;3 포함&#39;하고 기본 HIS3의 현장에서 염색체 XV 중 하나를 복사에 있습니다. 두 번째 기판, his3 - Δ5 &#39;는, 염색체 III 중 하나를 복사에 LEU2 현장에 위치하고 있으며, 5 들어 있습니다&#39;HIS3 allele을 잘립니다합니다. 두 기판은 HO - endonuclease에 의해 절개를 대상으로 할 수있는 매춘부 endonuclease 인식 사이트 둘러싸인 있습니다. 매트 현장에 기본 호 endonuclease 인식 사이트는, 염색체 III의 두 복사본에 대한 모든 변종에 삭제되었습니다. 이것은 재조합 기판과 분석의 간섭에서 다른 깨진 염색체 끝이 간의 상호 작용을 방지할 수 있습니다. KAN - MX - 갈락토 오스 표시 - inducible 호 endonuclease 표현 카세트가 염색체 IV에 TRP1 현장에 삽입됩니다. 기판 주 311 BP이나 특수 요원으로 복구에 대한 HR 기계에서 사용할 수있는 HIS3 코딩 순서의 60 BP. HR로 깨진 염색체를 복구하는 이러한 기판을 사용하여 세포가 손상 HIS3 allele과 tXV를 형성 : 중간 부족한 히스티딘 (그림 2A)에서 성장하는 능력에 의해 선택하실 수 있습니다 III 염색체 translocation합니다. HR로 Translocation 주파수가 아닌 선택적 매체 (그림 2B)에 해당 dilutions을 도금 후 발생 가능한 세포의 총 숫자로 선발 매체에 발생 히스티딘 prototrophic 식민지의 수를 나누어 계산됩니다. DNA의 복구 돌연변이 다양한이 시스템은 12-14을 사용하여 특수 요원 translocation 형성의 유전자 조절을 연구하는 데 사용되었습니다.

HO - 자극 translocation 분석은 단일 가닥 diploid에서 여러 loci에서 DNA 이중 가닥 나누기의 창조 다음 풀림 모니터<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. 이 메커니즘은 이온화 방사선의 다량으로 복용에 노출 다음 높은 eukaryotes의 체세포의 게놈 rearrangements을 모델 수 있습니다.

HO - Endonuclease의 형성의 Quantitation과 분석에서 어닐링 단일 스트랜드에 의해 염색체 Translocations을 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

유전적 변이는 모든 유전체에 존재하는 분산 반복 요소들 사이의 상호작용을 통해 발생하는 게놈 재배열에 의해 자주 매개됩니다.

본 실험 과정의 전반적인 목표는 이배체 출아 효모 세포 내 단일 가닥 어닐링(single stranded annealing)에 의한 전좌 형성의 유전적 조절을 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 특정 유전자형의 단일 콜로니를 배양액에 접종하여 하룻밤 동안 배양합니다. 실험 과정의 두 번째 단계는 배양액에 galactose를 첨가하여 두 개의 염색체 상에서 ho 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의한 동시 이중 가닥 절단을 유도하는 것입니다.이 배양액들을 다음 단계로 희석하여 선택 배지와 비선택 배지에 도말합니다. 마지막 단계는 선택 배지와 비선택 배지에서 생성된 콜로니 수를 계산하여 전이 빈도를 결정하는 것입니다. 최종적으로, 서로 다른 유전자형을 가진 균주들에서 ho에 의해 자극된 전이 형성 빈도의 변화를 통해, 단일 가닥에 의한 전이 형성의 유전적 조절을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 기술의 함의는 암 환자의 치료 방사선 노출 결과로 확장되는데, 이는 DNA 이중 가닥 절단과 전좌 형성이 해당 치료의 주요 결과이기 때문입니다. ho 유도 전좌 빈도를 결정하는 절차를 시작하려면, 원하는 유전형의 단일 콜로니를 YP 글리세롤 젖산 배지 1mL 배양액 10~20개에 각각 접종하고, 회전 배양기에서 30 °C로 하룻밤 동안 배양하십시오. 배양액이 원하는 세포 밀도에 도달하면, 최종 농도가 2%가 되도록 20% 갈락토스를 배양액에 첨가하십시오. 갈락토스는 ho 엔도뉴클레아제의 발현을 유도하며, 이는 염색체 3의 his3-delta 5' 대립유전자와 염색체 15의 his4-delta 3' 대립유전자에 이중 가닥 절단을 유도합니다. 이후 회전 배양기에서 30 °C로 4시간 동안 배양하십시오.다음 단계는 실험 절차의 성공에 매우 중요합니다. 배양액을 세심하게 희석하고 도말하는 것이 필수적입니다. 서로 다른 유전자형을 가진 균주 간에 통계적으로 유의미한 비교가 가능할 만큼 충분히 재현성 있는 전위 빈도를 얻으려면, 4시간 후에 배양액을 적절히 희석하여 히스티딘이 결핍된 배지와 YPD 배지에 각각 도말하십시오. 플레이트당 약 100~200개의 콜로니가 형성되도록 하며, 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다.콜로니가 형성되면 전좌 빈도를 결정할 수 있습니다. ho 엔도뉴클레아제 발현 유도 전후의 도말 효율을 통해, 전좌 염색체의 존재 또는 부재가 DSB 형성 시 생존 능력에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다. 유도 전 도말 효율을 결정하기 위해 염색체 3번과 15번의 각 한 개 복제본을 절단합니다.먼저, 하룻밤 동안 배양한 각 배양액에서 세포 분주액을 취하고, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 다음으로, 적절한 희석 배율을 사용하여 YPD 배지에 약 100~200개의 세포를 도말하고, 콜로니가 형성될 때까지 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다. 남은 배양액에는 20% galactose를 최종 농도가 2%가 되도록 첨가하고, 30 °C에서 4시간 동안 배양하여 유도 후 도말 효율을 결정합니다.유도 4시간 후 각 배양액에서 세포 분주액을 채취하고, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 적절히 희석하여 YPD 배지에 약 100~200개의 세포를 도말한 후, 콜로니가 형성될 때까지 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다. 플레이트에 콜로니가 형성되면 도말 효율을 결정할 수 있습니다. 전위가 일어난 것으로 추정되는 클론은 Southern blot으로 확인할 수 있습니다.이 절차에서는 각 독립적인 시험에서 준비된 단일 hiss 플러스 재조합 콜로니로부터 추출한 게놈 DNA를 사용합니다. 각 DNA 샘플 약 4 µg을 BAM H1 제한 효소로 소화시킨 후, BAM H1으로 소화된 단편들을 0.7% agarose 겔에서 분리하고, 이를 양전하 나일론 막으로 전이시킵니다. HIS3 유전자를 포함하는 1.8 kb BAM H1 게놈 클론을 사용하여 random priming 방식으로 제작한 P 32 표지 프로브로 하이브리드화합니다. DNA 단편은 자동 방사선 촬영법 또는 인광 이미징을 통해 시각화합니다. 전좌가 일어난 것으로 추정되는 클론을 검사하는 또 다른 방법으로는 염색체 플롯 분석이 있습니다.먼저 선택된 hiss plus 재조합체로부터 염색체를 준비하여 aros plug에 넣고, 14°C의 contour clamped homogeneous electric field(CHEF) 환경에서 1% aros gel을 사용하여 염색체를 분리합니다. 사용되는 파라미터는 다음과 같습니다. 첫 번째 블록: 14°C, 스위치 시간 72초, 6 V/cm에서 15시간; 두 번째 블록: 14°C, 스위치 시간 122초, 6 V/cm에서 11시간. 전기영동이 완료되면, 겔을 EtBr로 30분 동안 염색하여 염색체를 시각화한 후, UV를 조사하고 증류수로 탈색합니다. 모세관 현상을 이용하여 염색체를 양전하 막으로 전이시킵니다.변성 조건에서 his3 유전자를 포함하는 1.8 kilobase bam H one bam H one 게놈 클론을 random priming으로 사용하여 얻은 P 32 표지 프로브와 하이브리드화합니다. 자동 방사선 촬영 또는 인광 이미징을 통해 염색체를 시각화합니다. 염색체 전위 빈도는 YPD 배지에 도말하여 결정한 총 생존 세포 수로 히스토신 영양요구성 콜로니 수를 나누어 계산할 수 있습니다.이 예시에서 계산된 재조합 빈도는 약 3%입니다. ho 자극 전좌 빈도 분석은 서로 다른 유전자형의 균주를 사용하여 단일 가닥에 의한 이중 가닥 절단 복구 능력의 차이를 비교함으로써 수행할 수 있으며, 이는 이 대표 그래프에 나타난 바와 같습니다. RAD 51 delta null 동형접합체에서 선택적 및 비선택적으로 얻은 전좌 빈도는 유도 전후 플레이팅의 해당 조건에서 야생형 균주를 사용하여 얻은 빈도와 통계적으로 유의미한 차이를 보였습니다.효율은 이 표에 표시된 유도 전후 도말의 헤모사이토미터 계수로 측정된 배양액 내 총 세포 수로 생존 가능한 콜로니 형성 세포의 총 수를 나누어 결정합니다. 야생형 세포의 경우 효율에 유의미한 차이가 없었으며, 이는 전좌 염색체의 존재 여부가 생존 능력에 영향을 미치지 않음을 시사합니다. DSB 형성.전이(translocation)가 일어난 것으로 추정되는 클론은 게놈 서던 블롯(genomic southern blot) 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 전이 형성 전후의 관련 염색체에 대한 도식적 표현이 여기에 제시되어 있습니다. 부모 균주와 재조합 균주의 게놈 DNA를 BamHI로 제한효소 절단하여 생성된 관련 서열 포함 제한 단편의 크기는 1.8 kb BamHI 단편과의 하이브리드화를 통한 블롯 분석으로 확인할 수 있습니다.Southern blot 분석을 위해 HIS3 게놈 클론 3개를 킬로베이스 쌍(kilobase pairs) 단위로 나열하였습니다. 게놈 DNA를 BMH1 엔도뉴클레아제로 절단하고, 진단 단편들을 시각화하기 위해 P 32로 표지된 1.8킬로베이스 HIS3 프로브와 하이브리드화하였습니다.0.8 kilobase HIS3Δ20, 1.7 kilobase HIS3Δ3', 4 kilobase T315, 5 kilobase T153 및 8 kilobase HIS3Δ5' 단편들입니다. 레인 A는 부모 이배체입니다. 레인 B는 HIS+ 비상호 전좌 재조합체이며, 레인 C는 HIS+ 상호 전좌체입니다.재조합 염색체 BLO 분석은 전좌를 포함하는 클론을 조사하는 데에도 이용될 수 있습니다. aros 플러그로 준비된 온전한 염색체들을 chef 전기영동으로 분리하고, 겔을 iridium bromide로 염색한 후 UV 광원 아래에서 시각화합니다. 이렇게 분리된 염색체들을 나일론 막에 전이시킨 다음, P 32 표지 1.8 kilobase로 하이브리드화합니다.1.1 megabase의 온전한 chromosome 15, 8 megabase의 T 15 three 전좌 염색체, 0.6 megabase의 T three 15 전좌 염색체 및 0.3 megabase의 온전한 chromosome three를 시각화하기 위한 세 가지 프로브입니다. Lane A는 부모 균주입니다. Lane B는 his+ 비상호 전좌 재조합체이며, Lane C는 his+ 상호 전좌 재조합체입니다.이 영상을 시청하고 나면, 다중 Ho 자극에 의한 이중 가닥 절단 이후 전위 형성 빈도를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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이 프로토콜은 HEK-293T 세포에서 NHEJ 및 HR의 효율성을 정량화하기 위한 염색체 외 비상동 말단 결합(NHEJ) 분석 및 상동 재조합(HR) 분석을 설명합니다.

GFP 기반 리포터 시스템을 사용한 HEK-293T 세포의 비상동성 말단 접합 및 상동 재조합 효율 분석

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

배우세요 HO 엔도뉴클레아제를 이용한 이중가닥 절단 유도 및 단일가닥 어닐링을 통한 Saccharomyces cerevisiae 염색체 전좌 형성의 유전적 조절 메커니즘 분석 방법. 이 기법은 방사선 치료 후 유전체 안정성 연구에 활용됩니다.

HO - Endonuclease의 형성의 Quantitation과 분석에서 어닐링 단일 스트랜드에 의해 염색체 Translocations을 자극 Saccharomyces cerevisiae

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