0 조회수 • 4:47 분 • April 28th, 2025
해부된 초파리 배아를 유리 슬라이드에 테이프로 고정하는 것으로 시작합니다.
파리의 운동 뉴런은 시각화를 위해 형광 라벨링됩니다.
현미경을 사용하여 배아를 시각화하고 녹색 형광 친유성 염료로 채워진 마이크로피펫을 배아 근처에 배치합니다.
그런 다음 형광 모드로 전환하고 운동 뉴런이 근육에 연결되는 신경근 접합부에서 운동 뉴런의 축삭 끝을 찾습니다.
명시야 모드로 전환하고 대상 축삭의 끝을 피펫으로 접촉하고 염료 방울을 방출한 다음 배양합니다.
친유성 특성과 축삭 부근으로 인해 염료는 표적 축삭의 지질이 풍부한 막에 선택적으로 들어갑니다.
시간이 지남에 따라 염료는 역행하여 축삭 지질 이중층을 따라 신경체를 향해 뒤로 이동하여 신경 돌출부에 라벨을 붙입니다.
슬라이드에서 테이프를 제거하고 커버슬립을 놓습니다.
공초점 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다.
역행 표지 표적 뉴런은 녹색 형광으로 나타나 상세한 뉴런 형태와 투영을 보여줍니다.
해부 현미경 아래에서 유리 바늘을 사용하여 배아의 내부 조직이 손상되지 않도록 주의하면서 테이프에서 유리로 배아를 잎사막에서 끌어냅니다. 그런 다음 단일 배아의 표면에서 정중선을 뒤쪽에서 앞쪽 끝으로 자릅니다. 상피 조직을 중앙에서 반집하고 표피 가장자리를 유리 슬라이드 표면에 부착합니다.
끝 구멍이 약 300마이크로미터인 튜브 연결 바늘을 사용하여 공기를 흡인하거나 불어 등쪽 세로 기관 줄기와 남아 있는 내장을 제거합니다. 4% PFA 및 PBS를 사용하여 오비탈 셰이커에서 실온에서 5분 동안 배아를 고정합니다. 그런 다음 PBS로 세 번 씻으십시오.
시아닌 3 염료와 200마이크로리터의 PBS와 접합된 항-양 고추냉이 과산화효소 항체 1마이크로리터로 안와 셰이커에서 1시간 동안 배아를 염색합니다. 그리고 PBS에서 세척을 반복합니다. 주입 마이크로피펫을 채우려면 모세관 홀더에 넣으십시오. 그런 다음 염료 슬라이드를 스테이지에 놓고 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 슬라이드 위에 배치합니다.
그런 다음 스테이지를 조정하여 마이크로피펫을 염료 위에 놓습니다. 주입 압력을 200에서 500헥토파스칼 사이로, 주입 시간을 0.1에서 0.5초 사이로, 보상 압력을 5분 동안 0으로 설정하여 염료와 마이크로피펫을 수집합니다. 염료가 수집되면 염료 슬라이드를 제거하고 샘플을 현미경 스테이지에 놓습니다.
그런 다음 보상 압력을 30 내지 60헥토파스칼 범위로 높이고 마이크로피펫을 샘플 안으로 내립니다. 10배 대물 렌즈를 사용하여 배아를 찾고 마이크로피펫을 배아에 맞춥니다. 대물렌즈를 40배 침수 렌즈로 바꾸고 렌즈를 PBS에 담그십시오.
형광 현미경을 사용하여 항-HRP Cy3로 표시된 신경 형태를 확인하고 주사 부위를 결정합니다. 배아에 초점이 맞춰지면 마이크로피펫의 위치를 변경하여 관심 축삭의 끝과 부드럽게 접촉합니다. 그런 다음 주입 중에 명시야 현미경을 사용하여 염료 방울을 확인합니다. DiD 또는 DiO를 사용하여 ACC 또는 RP3의 신경근 접합부에 있는 오른쪽 복부 반분절에 염료를 떨어뜨립니다.
핸드 컨트롤을 사용하여 염료를 제거하고 마이크로피펫을 제거합니다. 그런 다음 다음 주사 부위로 이동합니다. 이미징 전에 오비탈 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 미세한 집게를 사용하여 유리 슬라이드에서 테이프를 제거합니다.
샘플을 장착하려면 네 모서리에 소량의 진공 그리스가 있는 커버슬립을 준비하십시오. 기포가 생기지 않도록 샘플 위에 조심스럽게 놓으십시오. 커버슬립을 아래로 눌러 대물 렌즈와 슬라이드 사이의 작동 거리를 허용하기 위해 샘플의 공간을 조정합니다.
작업 초기화로 초과 PBS를 제거합니다. 매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 완전히 밀봉하십시오. 공초점 현미경으로 10배 및 100배 배율로 이미지를 촬영하고 ImageJ 소프트웨어로 이미지를 처리합니다.