디콘볼루션 현미경을 사용한 마우스 1차 시상하부 뉴런의 GLUT4 단백질 트래픽 이미징

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신경과학

0 조회수 • 3:38 분 • April 28th, 2025

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멀티웰 플레이트의 폴리-D-라이신 코팅 커버슬립에서 배양된 야생형 및 CCR5-녹아웃 마우스 일차 시상하부 뉴런으로 시작합니다.

이 뉴런은 세포질에서 녹색 형광 단백질 태그 포도당 수송체-4(GFP-GLUT4)를 발현합니다.

커버슬립을 슬라이드 유리 시트에 옮기고 이미지 획득 중 안정성을 보장하기 위해 과도한 매체를 부드럽게 닦아냅니다.

커버슬립이 아래를 향하도록 디콘볼루션 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓습니다.

명시야 조명 하에서 뉴런을 시각화한 다음 케모카인 CCL5와 인슐린으로 순차적으로 치료합니다.

형광 조명으로 전환하여 GFP-GLUT4 발현 표적 뉴런을 식별하고 이미징 매개변수를 조정하여 실시간 형광 이미지를 캡처합니다.

야생형 뉴런에서 인슐린과 CCL5는 각각 인슐린 수용체 및 CCR5에 결합하여 GFP-GLUT4 막 전좌를 유도하는 다운스트림 신호 전달 경로를 활성화합니다.

CCR5 녹아웃 뉴런에서 CCL5는 결합에 실패하여 GFP-GLUT4 전좌가 감소합니다.

이미지를 캡처하고 디콘볼루션 알고리즘을 적용하여 초점이 맞지 않는 빛을 줄이고 이미지 선명도와 해상도를 향상시킵니다.

라이브 이미징을 위해 세포를 준비하려면 집게를 사용하여 뉴런이 있는 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 유리 슬라이드 위에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 섬세한 작업용 물티슈로 여분의 매체를 두 번 접고 움직이지 않고 커버슬립 위에 조심스럽게 놓아 제거합니다.

커버슬립에서 불필요한 움직임을 방지하기 위해 과도한 양의 배지를 제거하는 것이 중요합니다.

다음으로, 선택한 세포 샘플을 밀리리터당 10나노그램의 CCL5 또는 밀리리터당 10단위의 인슐린으로 1분 동안 처리합니다. 그런 다음 커버슬립 가장자리에 1.5마이크로리터의 희석된 인슐린을 추가합니다. 그런 다음 60배 배율 1.52NA 대물렌즈에 침지 오일을 추가합니다.

그런 다음 커버슬립이 아래를 향하도록 하고 적절하게 고정한 상태에서 디콘볼루션 현미경 스테이지에 커버슬립을 놓습니다. 명시야 또는 형광 조명을 사용하여 표적 세포를 식별합니다. 그런 다음 표적 세포가 명확하게 관찰될 때까지 초점을 조정합니다. 불필요한 긁힘 자국을 방지하기 위해 대물 렌즈를 커버슬립 영역 밖으로 이동하지 마십시오.

다음으로, GFP 신호로 GFP-GLUT4를 식별합니다. 그런 다음 이미지 획득을 위해 원하는 표적 세포를 식별합니다. 그런 다음 픽셀 수, 여기 파장, 투과율, 노출 시간, 스택 두께, 시간 간격 및 총 이미징 시간을 포함하여 각 대상 셀에 적절한 실험 매개변수를 설정합니다. 노출 매개변수를 약 2,000 - 3,000 카운트로 조정하여 최대 픽셀 강도를 달성합니다.

형광 광표백을 최소화하려면 노출 시간을 1초 미만으로 유지하면서 여기광 투과율을 최대한 줄이십시오. 표적 셀의 상단과 하단이 모두 약간 초점이 맞지 않을 때까지 현미경 스테이지를 움직여 각 표적 셀에서 z-스택의 상한과 하한을 설정합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026