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신경과학
0 조회수 • 5:09 분 • April 28th, 2025
마우스 뇌의 해마 조각을 버퍼가 들어 있는 우물에 넣습니다. 슬라이스에는 시냅스를 통해 통신하는 뉴런 네트워크가 포함되어 있습니다.
시냅스 전 뉴런 말단에는 특징적인 막관통 수송체가 있는 신경 전달 물질로 채워진 소포가 포함되어 있는 반면, 시냅스 후 말단은 신경 전달 물질 수용체를 조절하는 특징적인 스캐폴드 단백질을 특징으로 합니다. 둘 다 시냅스 구조의 핵심 마커 역할을 합니다.
완충액을 투과화 차단 용액으로 교체하고 교반하면서 배양하여 세포막을 투과화하고 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
시냅스 전 및 시냅스 후 마커를 표적으로 하는 1차 항체를 추가하고 결합을 허용하기 위해 교반하면서 배양합니다.
슬라이스를 세척하고 1차 항체에 특이적인 형광단 접합 2차 항체를 추가한 다음 어둠 속에서 교반하면서 배양합니다.
슬라이스를 씻은 다음 슬라이드에 장착합니다.
공초점 현미경을 사용하여 관심 영역을 식별하고 확대하여 시냅스를 시각화합니다.
형광 표지된 시냅스 전 및 시냅스 후 마커를 식별하고 시냅스에서 공동 국소화를 평가하기 위해 이미지를 캡처합니다.
면역형광 염색을 시작하려면 슬라이스 웰의 PBS를 블로킹 및 투과화 완충액으로 교체하고 셰이커에서 실온에서 4-6시간 동안 배양합니다. 블로킹 단계가 끝날 무렵, VGLUT1 1 내지 2000에 대한 항체를 블로킹 및 투과화 완충액으로 희석한다. 이 희석액은 사용하는 항체의 회사 및 로트에 따라 다를 수 있습니다. 슬라이스를 1차 항체 용액에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 격렬한 움직임으로 흔들리는 플랫폼을 사용하십시오.
최적의 염색을 위해서는 1차 항체와 2차 항체의 균일한 분포가 중요합니다. 우리의 경험에 따르면 격렬한 흔들림은 최상의 항체 침투를 가능하게 합니다.
1차 항체에서 배양한 후, 슬라이스를 PBS에서 이전과 같이 매번 10분 동안 3회 세척합니다. 마지막 세척 중에 적절한 2차 항체를 차단 완충액에서 1 내지 500으로 희석합니다. 그런 다음 이 용액에서 슬라이스를 실온에서 2-3시간 동안 배양합니다. 2차 항체는 빛에 민감하므로 슬라이스가 빛으로부터 보호되는지 확인하십시오.
이전과 같이 슬라이스를 세척한 후 브러시를 사용하여 24웰 플레이트에서 슬라이스를 조심스럽게 제거하고 미리 라벨이 붙은 유리 슬라이드 위에 고르게 놓습니다. 각 슬라이스 위에 마운팅 매체 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 기포가 생기지 않도록 주의하면서 슬라이스 위에 유리 커버슬립을 부드럽
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