이미징 : Hippocampal Neuronal Activation In Mouse Brain Sections

뉴런이 풍부한 등쪽 해마를 노출시키는 마우스 뇌 절편부터 시작합니다.

과산화수소를 첨가하여 신경 과산화효소 활성을 소멸시킨 다음 세척합니다.

투과화 완충액으로 처리한 다음 차단 완충액을 적용하여 비특이적 결합을 차단합니다.

1차 항체를 추가하고 교반하면서 배양합니다. 이 항체는 신경 활성화 마커 단백질에 결합합니다.

비오틴 접합 2차 항체를 세척하고 적용하여 1차 항체에 결합합니다.

접합체의 비오틴에 결합하는 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체를 헹구고 도입합니다.

다시 세척한 다음 과산화효소에 의해 산화되어 갈색 침전물을 생성하는 발색 기질을 추가합니다. PBS로 반응을 중지합니다.

절편을 젤라틴 코팅 슬라이드로 옮기고 농도를 증가시키는 에탄올을 사용하여 탈수합니다. 그런 다음 자일렌의 섹션을 제거하고 장착합니다.

슬라이드를 명시야 현미경 아래에 놓습니다.

빛 조명 아래에서 염색되지 않은 영역은 빛을 투과시켜 밝게 보이는 반면, 염색된 뉴런은 빛을 흡수하고 반사하여 더 어둡게 보입니다.

뚜렷하게 어두운 영역은 해마 내의 신경 활성화를 나타냅니다.

각 마우스에 대해 3-5개의 등쪽 해마 절편을 각 웰에 대해 500마이크로리터의 0.1몰 PBS를 포함하는 24-다중 웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 각 웰에 포함된 절편을 500마이크로리터의 0.1몰 PBS로 세척합니다. 달리 언급되지 않는 한 모든 세척 및 배양은 실온에서 부드럽게 교반하면서 수행하십시오. 훈기 후드 아래에서 내인성 과산화효소 활성을 소멸시키기 위해 40% 메탄올, 0.1몰 PBS에 1% 과산화수소 절편을 20분 동안 배양합니다.

0.1몰 PBS에서 3회 더 세척한 후, 절편을 500마이크로리터의 0.2% Triton X-100에서 5분 동안 배양하여 투과화합니다. 절편이 배양되는 동안 전체 실험을 위한 충분한 차단 완충액을 준비하십시오. 그런 다음 투과화 용액을 제거하고 각 웰에 100마이크로리터의 차단 완충액을 추가합니다. 절편을 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 블로킹 완충액을 제거하고 블로킹 완충액에서 1 내지 500으로 희석한 인산화된 세포외 조절 키나아제 1차 항체로 절편을 덮습니다. 부드럽게 교반하면서 섭씨 4도에서 밤새 절편을 배양합니다. 다음날, 절편을 0.1몰 PBS에서 각각 5분 동안 3회 세척한 후, 1 내지 250 차단 완충액으로 희석된 비오틴 접합 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한다.

배양하는 동안 아비딘과 비오틴 복합체가 형성될 수 있는 충분한 시간을 허용하기 위해 사용하기 최소 30분 전에 ABC 시약을 준비하십시오. 0.1몰 PBS로 절편을 세 번 더 세척한 후 ABC 시약을 첨가하고 샘플과 함께 45분 동안 배양합니다. PBS에서 다음 세 번의 세척 세트 동안 제조업체의 사양에 따라 흄 후드에서 dab 작업 용액을 준비합니다. 플레이트에 DAB 작업 용액을 분취합니다.

그런 다음 단편을 DAB 작업 용액이 포함된 웰로 옮기고 플레이트를 천천히 소용돌이쳐 절편이 용액에 최대한 노출될 수 있도록 합니다. 약 2-5분 후에 적절한 신호가 나타날 때까지 현미경으로 DAB 반응을 모니터링합니다. 0.1몰 PBS에서 조직을 세척하여 원하는 색상 강도에서 반응을 중지합니다. PBS에서 세 번 더 세척한 후, 젤라틴 코팅 슬라이드에 절편을 장착하고 실온에서 최소 3-4시간 동안 건조시킵니다.

공기 건조되면 슬라이드를 연 후드에 옮기고 절편을 각각 2분 동안 등급이 매겨진 에탄올 용액에 순차적으로 넣어 탈수합니다. 그런 다음 슬라이드를 100% 자일렌으로 5분 동안 제거합니다. 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 덮고 밤새 퓨머 후드에 두어 건조시킵니다.

슬라이드를 20x 대물 렌즈의 카메라가 장착된 명시야 현미경으로 옮깁니다. 등쪽 해마를 덮는 200배 배율로 각 섹션에서 여러 개의 명시야 이미지를 획득합니다. 각 동물의 3-5개 섹션을 이미지화합니다.