Imaging intracellular ATP Dynamics Using FRET-based sensors in an organotypic mouse hippocampal slice(유기형 마우스 해마 절편에서 FRET 기반 센서를 사용한 세포 내 ATP 역학 이미징)
0 조회수 • 3:40 분 • April 28th, 2025
실험실에 기관형 마우스 해마 절편을 고정합니다.
슬라이스에는 기증자 및 수용체 형광 단백질로 ATP 센서를 발현하는 형질도입된 뉴런과 성상세포가 포함되어 있습니다.
챔버를 형광 현미경 스테이지에 놓고 산소가 함유된 ACSF로 관류합니다.
슬라이스가 버퍼링된 조건에 적응하도록 허용합니다.
투과광을 사용하여 슬라이스에 초점을 맞추고 관심 영역을 식별합니다.
형광 모드로 전환하고 기증자 형광 단백질을 여기시켜 형광 방출을 시작합니다.
ATP 결합 시 센서는 형태 변화를 겪어 기증자에서 수용체로 형광 기반 에너지 전달을 가능하게 하여 더 긴 파장에서 형광을 방출합니다.
이색성 미러와 대역 통과 필터를 사용하여 공여자와 수용체 방출을 분리하고 분리합니다.
배경 빼기를 위해 형광이 없는 영역을 선택합니다. 그런 다음 표적 세포를 식별하고 시간 경과에 따른 형광을 기록합니다.
세포내 ATP 수치를 실시간으로 모니터링하기 위해 FRET 비율을 계산합니다.
실험용 ACSF를 준비하고 카보겐 공급에 연결된 삽입된 튜브를 통해 95% 산소와 5% 이산화탄소로 최소 30분 동안 버블링하여 pH 7.4를 얻습니다. 전체 실험 동안 식염수를 거품으로 유지하십시오. 그런 다음 단색기의 형광등을 켭니다.
기관형 절편 배양액을 실험실로 옮깁니다. 배양액에 닿지 않고 프레임을 아래로 향하게 하고 실을 위로 하여 막에 닿도록 기관형 슬라이스 배양액 위에 격자를 놓습니다. 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 관류 시스템에 연결합니다.
분당 1.5-2.5밀리리터의 유속으로 연동 펌프를 켭니다. 관류 시스템이 누출되지 않았는지 확인하십시오. 투과광을 사용하여 배양된 슬라이스에 초점을 맞추고 실험을 수행할 영역을 식별합니다.
이미징 실험을 시작하기 전에 슬라이스가 식염수 조건에 적응할 때까지 최소 15분 동안 기다리십시오. 그런 다음 카메라와 이미징 소프트웨어를 켭니다. 435나노미터에서 기증자 형광 단백질을 여기시킵니다. 노출 시간을 40밀리초에서 90밀리초 사이로 설정합니다.
그런 다음 이색성 거울과 필터를 빔 스플리터 장치에 삽입합니다. 방출 이미지 스플리터를 사용하여 500나노미터에서 형광 방출을 분할하고 482 플러스 또는 마이너스 16 및 542 플러스 또는 마이너스 13.5나노미터에서 대역 통과 필터를 사용하여 공여체 및 수용체 형광을 추가로 분리합니다.
배경 빼기를 위해 세포 형광이 없는 것으로 보이는 관심 영역을 선택합니다. 화면의 이미지에서 라벨링된 조직의 단일 구조에 동그라미를 치어 ROI를 생성합니다. 전체 녹화 시간에서 이미지 획득 빈도를 설정합니다. 30분 이상의 실험의 경우 광독성을 방지하기 위해 0.2-0.5헤르츠의 획득 빈도를 권장합니다. 그런 다음 녹음을 시작합니다.
개요
본 논문에서는 기관형 마우스 해마 절편에서 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 이용하여 세포 내 ATP 수준을 실시간으로 모니터링하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 도너(donor) 및 억셉터(acceptor) 형광 단백질이 포함된 ATP 센서를 발현하도록 형질전환된 뉴런과 성상교세포를 사용하는 것을 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 형광 이미징
배경
- 세포 내 ATP 수준은 세포 기능에 결정적인 역할을 합니다.
- FRET은 살아있는 세포 내의 분자 상호작용을 연구하는 강력한 기술입니다.
- 장기모사 슬라이스 배양은 뇌 조직의 구조와 세포 구성을 유지합니다.
- 형광 단백질을 통해 생물학적 과정의 실시간 이미징이 가능합니다.
연구 목적
- 생체 뇌 절편 내 ATP 수준을 실시간으로 모니터링하는 방법을 개발한다.
- 세포 에너지 상태를 평가하기 위해 FRET을 활용한다.
- 뉴런 및 글리아 세포의 ATP 역동성에 대한 이해를 증진한다.
사용된 방법
- 마우스 해마의 장기 배양 조직 절편 준비.
- ATP 센서를 이용한 뉴런 및 성상교세포의 형질도입.
- FRET 신호 모니터링을 위한 형광 현미경 사용.
- 정확한 측정을 위한 배경 감산 및 관심 영역(ROI) 선택.
주요 결과
- 실험 조건에 대한 슬라이스의 성공적인 적응.
- FRET 비율을 통한 ATP 수준의 실시간 모니터링.
- ATP 변동에 따른 세포 반응 확인.
- 광독성을 최소화하기 위한 최적의 이미징 파라미터 설정.
결론
- 이 방법은 살아있는 뇌 조직 내의 ATP 역학을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다.
- FRET 기반 이미징은 세포 에너지 대사에 대한 통찰을 제시할 수 있습니다.
- 이 기술은 다양한 실험 조건에 적용되어 뉴런 기능을 탐구하는 데 활용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
살아있는 뇌 조직 내의 세포 내 ATP 역학을 모니터링하면 세포 에너지 상태와 기능적 결과의 연관성을 통해 신경치료 표적의 기전적 위험을 제거할 수 있습니다. 이 FRET 기반 접근법은 생리적 조건에서 뉴런 및 글리아 세포 대사에 대한 정량적인 실시간 판독값을 제공함으로써 초기 발견 단계의 표적 검증을 지원합니다. 이 방법은 조직 구조를 보존하는 동시에 약물적 또는 유전적 섭동에 반응하는 ATP 변동의 종단적 평가를 가능하게 하여 전임상 모델의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 질환 관련 회로에서 ATP 역학을 신경세포 및 성상교세포 활성과 상관시켜 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 일차 배양 유사 조직에서 유전적으로 부호화된 센서를 사용하여 기능적 타겟 검증을 위한 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.
- 예측적 가치: 기능적 또는 독성학적 표현형에 앞서 나타날 수 있는 초기 대사 변화를 감지함으로써 리드 물질 발굴을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 실험 조건 전반에 걸쳐 세포 내 ATP 수준을 정량화하기 위한 표준화된 FRET 비율 지표를 설정합니다.
- 재현성: 배경 제거 및 ROI 선택을 가능하게 하여 변동성을 최소화하고 종단적 이미징에서 신호 특이성을 보장합니다.
- 확장성: 다중 웰 또는 시계열 스크리닝 형식의 관류 시스템 및 자동 획득 설정과 호환됩니다.
중개 및 전임상 연구
- 전이적 연속성: 해마 슬라이스의 구조를 유지하여 ATP 역학을 생체 내 뉴런 네트워크로 외삽할 수 있도록 지원합니다.
- 기전적 리스크 감소: 표적 결합을 세포 에너지 상태와 연결함으로써 작용 기전 연구의 모호함을 줄여줍니다.
- 리스크 조정 기반의 진전: 생리학적으로 유의미한 표본에서 ATP 항상성을 파괴하는 화합물을 식별함으로써 go/no-go 결정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 타겟 검증부터 전임상 프로파일링에 이르는 발견 연속체에 적합하며, 실시간 ATP 모니터링을 통해 작용 기전과 세포 독성 평가를 모두 수행할 수 있습니다.
- 발견 생물학: 센서 유래 FRET 비율을 뉴런 및 성상교세포의 세포 에너지 플럭스와 연결함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 정의된 여기/방출 설정 및 배경 감쇄 프로토콜을 통해 분석법의 표준화를 가능하게 합니다.
- 분석: 처리군 또는 유전적 모델 간의 ATP 수준을 비교할 수 있는 정량적 FRET 비율 판독값을 생성합니다.
- 중개 연구: 조직 수준의 복잡성을 유지하여 인비트로(in vitro) 연구 결과와 온전한 회로 수준의 생리학적 특성을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 여러 신경치료 프로그램에 걸쳐 종단적 대사 프로파일링이 가능한 재사용 가능한 이미징 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 신경활성 화합물 스크리닝에서 기전적 모호성을 줄임으로써 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 핵심 이미징 시설 워크플로우와 호환되는 표준화되고 재현 가능한 형광 판독 결과를 제공합니다.
- 전략적 가치: 미토콘드리아 또는 대사 관련 결함을 조기에 발견할 수 있게 하여 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 질환 관련 조직의 ATP 항상성 프로파일을 기반으로 화합물의 위험 조정 우선순위 지정을 용이하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 형광 현미경, FRET 이미징 및 장기형 절편 배양 유지에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 공여체/수용체 분리를 위해 다이크로익 미러, 밴드패스 필터 및 고감도 카메라가 장착된 공초점 또는 광시야 시스템이 필요합니다.
- 이미징 중 ACSF 공급 및 환경 제어를 위한 관류 시스템이 필수적입니다.
- 신호 품질과 광독성의 균형을 맞추기 위해 들뜸 파장(435 nm), 노출 시간(40–90 ms) 및 획득 빈도(0.2–0.5 Hz)의 최적화가 포함됩니다.
- 센서 발현의 가변성 및 정확한 FRET 비율 계산을 위한 배경 제거의 필요성으로 인해 제한이 있습니다.
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마지막 업데이트: 29 8월 2026