마우스 망막의 Two-Photon In Vivo 이미징

마우스 망막의 생체 내 이미징을 위해 머리를 홀더에 비스듬히 고정한 마취된 형질전환 마우스를 취합니다.

망막에는 형광단 태그 단백질을 발현하는 망막 신경절 세포 또는 RGC가 포함되어 있습니다.

눈 윤활제를 바르고 눈 위에 커버슬립을 장착합니다.

현미경으로 망막을 균일하게 비추어 RGC의 형광 단백질을 여기시킵니다.

방출된 형광을 사용하여 초점면 RGC와 초점이 맞지 않는 RGC의 광시야 뷰를 얻습니다.

2광자 이미징 모드로 전환하여 저에너지 근적외선을 RGC 레이어에 집중시킵니다.

초점에서 두 광자의 결합된 에너지가 형광단을 여기시킨 다음 형광단이 형광으로 에너지를 방출합니다.

여기가 단일 지점에 국한되기 때문에 다른 초점면의 형광이 최소화됩니다.

z축을 따라 여러 초점면에서 이미지를 캡처하여 전체 RGC 레이어를 이미지화합니다.

마우스의 양쪽 눈에 윤활제 점안액을 바릅니다. 한쪽 눈의 동공이 광 경로와 일직선이 될 때까지 헤드 홀더의 메인 암을 돌리고 1.5번 커버슬립을 소형 필터 홀더에 넣습니다. 홀더를 현미경 스테이지에 고정한 후 각막에 닿지 않고 윤활제 i-젤에 닿을 때까지 커버슬립을 내립니다. 그리고 광시야 여기광이 각막을 완전히 덮을 때까지 xy 차원과 대물렌즈 z 위치의 스테이지를 조정합니다.

안렌즈를 사용하여 망막의 형광 세포 또는 구조에 초점이 맞춰질 때까지 z 위치를 계속 조정하고 관심 있는 개별 세포 또는 구조를 해결하기 위해 필요에 따라 낙산화 형광 조명기를 증가시킵니다. 망막과 이미징 광 경로의 정렬을 미세 조정합니다. 초점면을 변경할 때 초점이 맞지 않는 빛의 팽창 또는 수축만 발생할 때까지 헤드 각도를 조정하여 xy 왜곡을 최소화합니다.

그런 다음 낙후형광 조명기를 끄고 조명기 셔터를 닫습니다. 2광자 이미징의 경우 모든 기관 레이저 안전 프로토콜을 따르십시오. 모든 주변광을 끄고 덮고 여기 광 경로를 레이저로, 방출 광 경로를 PMT로 전환합니다.

이미지 획득 소프트웨어에서 프레임 크기를 512 x 512로 설정하고 프레임 평균을 3으로 설정합니다. 스택의 맨 위에서 시작하여 아래쪽으로 진행하도록 z-스테핑을 설정하여 광수용체의 2광자 레이저 활성화를 최소화합니다. PMT를 켜고 활성화하고 전압을 680볼트로 조정합니다.

이미징 및 방출 셔터를 활성화합니다. 1% 레이저 출력에서 시작하여 표적 조직의 라이브 이미지 미리보기를 시작하고 디스플레이 밝기를 자동으로 조정하여 관심 있는 세포 또는 구조를 시각화합니다. 대상 조직이 어둡거나 불분명한 경우 45밀리와트를 초과하지 않고 구조가 보일 때까지 레이저 출력 비율을 높입니다.

현미경 스테이지를 xy 방향으로 조작하여 원하는 이미징 영역을 중심으로 하고 관심 있는 구조에 초점을 맞춘 z 평면으로 이동합니다. 만성 타임랩스 실험의 경우 이전에 얻은 이미지를 열어 관심 세포에 대한 참조로 사용하고, 현재 이미지의 이미징 각도가 이전 이미지의 이미징 각도와 유사한지 주의하십시오. 그런 다음 관심 있는 상단 및 하단 z 평면으로 이동하여 이미징 스택의 z 한계를 설정하고 이미지를 획득합니다.