0 조회수 • 4:02 분 • April 28th, 2025
원형 유리 이미징 창과 두개골에 이식된 헤드 플레이트가 있는 마취된 형질전환 마우스로 시작합니다.
미세아교세포 또는 면역 세포와 뉴런은 형광 단백질로 표지됩니다.
그런 다음 마우스를 2광자 현미경 스테이지에 고정합니다.
그런 다음 형광 염료를 복강 주입하여 혈관을 빨간색으로 염색합니다.
유리 이미징 창을 청소하고 식염수를 떨어뜨린 다음 현미경 대물렌즈를 내립니다.
다음으로 레이저 광을 설정하여 혈관 이미지를 캡처합니다. 분기 패턴과 좌표를 기록하여 나중에 동일한 영역을 찾고 이미지화합니다.
이제 형광 단백질을 여기시켜 미세아교세포와 뉴런이 형광을 발하도록 레이저를 설정합니다.
기록된 분기 패턴을 사용하여 동일한 영역을 찾고 정기적으로 세포 이미지를 캡처합니다.
혈관 네트워크와 뉴런은 안정적으로 유지되는 반면, 시간이 지남에 따라 미세아교세포 위치 변화는 신경 활동에 대한 반응으로 면역 역학을 반영합니다.
치과용 드릴 비트를 사용하여 두개골에 약 4mm의 원형 구멍을 뚫습니다. 드릴링하는 동안 정기적으로 멸균 식염수와 면봉으로 두개골을 적셔 뇌를 식히십시오. 뼈 파편을 제거하고 두개골 뼈를 부드럽게 합니다.
완료되면 뾰족한 집게로 두개골의 이 부분을 조심스럽게 제거합니다. 두개골을 제거한 후 식염수에 적신 작은 덮개 유리를 개두술에 조심스럽게 놓습니다. 멸균 물티슈를 사용하여 과도한 식염수를 말리십시오. 뾰족한 어플리케이터를 사용하여 창 주위에 시아노아크릴레이트 접착제를 바르고 뇌와 두개골에 부착되도록 합니다.
두개골의 나머지 부분에 프라이머 접착제를 바르고 경화 조명으로 20-40초 동안 경화시킵니다. 최종 접착제로 창 주위에 우물을 만들고 경화 조명으로 20-40초 동안 경화시킵니다. 프라이머 접착제로 개두술의 반대쪽 반구에 있는 두개골에 작은 헤드 플레이트를 붙인 다음 최종 접착제로 둘 다 20-40초 동안 경화시킵니다.
마우스가 깨어난 후 수술 후 진통제로 부프레노르핀 SR을 피하 1회 주사하면 72시간 동안 충분합니다. 건강한 회복을 촉진하기 위해 쥐에게 부드러운 음식을 추가로 제공하십시오. 이미징은 이식 수술 후 빠르면 2주부터 시행할 수 있습니다. 나사를 사용하여 헤드 플레이트를 2광자 현미경 스테이지에 장착하며, 가열판으로 섭씨 35도를 유지해야 합니다.
로다민 B와 같은 100마이크로리터의 혈관 염료를 마우스에 피하 주입합니다. 70% 에탄올을 두드린 면봉으로 두개창 표면을 부드럽게 청소합니다. 창문에 물이나 식염수 몇 방울을 떨어뜨리고 대물 렌즈를 용액에 내립니다. 대물렌즈가 낮아질 때 레이저가 꺼져 있는지 확인하십시오.
접안렌즈를 통해 바라보면서 주요 혈관 랜드마크를 나타내는 코스 지도를 손으로 그립니다. 이 도면을 사용하여 두 광자 이미징 중에 특정 영역을 식별합니다. 두 개의 광자 이미징을 사용하여 형광 세포 및 혈관의 이미지를 수집합니다. 이미징 매개변수는 텍스트 원고를 참조하십시오. 후속 이미징을 위해 정확한 영역을 다시 방문할 수 있도록 적절한 좌표로 주의 깊게 메모하십시오.
이 초기 이미징 세션에서 여러 시야를 수집합니다.