형질전환 마우스의 횡격막에서 신경근 접합부에서 칼슘 역학의 형광 이미징(Fluorescence Imaging of Calcium Dynamics at Neuromuscular Junctions in the diaphragm of a transgenic mouse)

질전환 마우스의 횡격막 신경이 있는 고정된 횡격막이 포함된 형광 현미경 설정으로 시작합니다.

횡격막의 신경근 접합부는 운동 뉴런, 근육 섬유, 아세틸콜린 수용체와 칼슘 채널을 포함하는 슈완 세포로 구성됩니다.

이 세포는 형광 표지된 아세틸콜린 수용체를 가지고 있으며 세포내 칼슘 지표를 발현합니다.

설정에 부착된 이미지 스플리터를 사용하면 두 형광 신호를 동시에 시각화할 수 있습니다.

횡격막 신경은 전기 자극을 전달하기 위해 흡입 전극에 위치합니다.

형광 현미경에서 아세틸콜린 수용체를 시각화하여 신경근 접합부를 식별합니다.

최대 기준선 형광을 설정하려면 염화칼륨 용액을 추가하여 세포막을 일시적으로 탈분극시킵니다. 이것은 세포내 칼슘 유입을 유발하여 지표의 형광을 증가시킵니다.

형광 신호의 과포화를 방지하기 위해 밝기 설정을 조정하십시오.

재분극 후 전기 자극을 가하여 세포로의 칼슘 유입을 유발하고 높은 프레임 속도로 세포 내 형광의 변화를 기록합니다.

20배 배율에서 녹색 노란색광 여기 하에서 형광 표지된 알파-방가로톡신 신경근 접합부를 찾아 근육 중심의 종판 밴드를 찾습니다. 청색광 여기로 전환하여 근육, 운동 뉴런 또는 슈완 세포의 칼슘 반응을 이미지화합니다. 이 예에서 GCaMP 3는 근육 세포에서 발현됩니다.

원하는 경우 이중 파장 이미징을 위해 대역 통과 필터와 이색성 단일 에지 필터로 이미지 스플리터를 설정합니다. 염화칼륨에 대한 반응으로 비닝 없이 유전적으로 암호화된 칼슘 지시약을 발현하는 조직이 20배 배율에서 포화도를 나타내는 수준의 110%로 설정된 룩업 테이블 막대의 밝기 막대로 실험을 수행합니다.

빠른 이벤트를 놓치지 않도록 초당 20프레임으로 녹화하세요. 흡입 전극을 사용하여 일련의 자극을 전달하여 20-40헤르츠의 신경 자극을 1-45초 동안 자극합니다. 그리고 정적 형광 표지된 알파-방가로톡신 신경근 접합부 신호와 함께 하나의 세포 아형에서 동적 형광 칼슘 반응을 수집합니다.