광학 분획기 기법을 사용하여 쥐의 뇌 조직에서 새로 생성된 뉴런 정량화

티미딘의 뉴클레오시드 유사체인 브로모데옥시우리딘 또는 BrdU를 주사한 쥐의 해마 뇌 절편을 채취합니다.

BrdU는 세포 분열 중에 DNA에 통합되어 신경 발생 영역인 치상회 내에서 새로 생성된 뉴런을 표지합니다.

내인성 과산화효소 효소를 비활성화하기 위해 산화제와 함께 배양합니다.

산으로 처리하여 DNA를 변성시키고 BrdU를 노출시킨 다음 산을 중화시킵니다.

세포막을 투과화하기 위한 세제 및 비특이적 결합 부위를 마스킹하기 위한 차단 용액과 함께 배양합니다.

BrdU를 표적으로 하는 1차 항체와 배양한 다음 1차 항체에 특이적인 과산화효소 태그 2차 항체와 배양합니다.

발

색 기질과 산화제를 도입하여 과산화효소가 기질을 유색 잔류물로 전환할 수 있도록 합니다.

조직을 장착하고 핵산 결합 염료로 대조염색합니다.

조직을 탈수한 다음 투명도를 높이기 위해 처리하십시오.

현미경으로 치상회를 식별합니다.

광학 분획기 기술을 사용하여 조직 두께 전체에 걸쳐 여러 평면을 분석하여 BrdU 표지 뉴런을 정량화합니다.

면역염색을 시작할 준비가 되면 절편이 실온까지 올라오도록 합니다. 그런 다음 붓을 사용하여 일련의 해마 절편에서 PBS로 채워진 페트리 접시에 놓인 25웰 염색망으로 5번째 절편마다 옮깁니다. 염색을 위해 해마당 8-12개의 절편이 있어야 합니다. 절편이 포함된 염색망을 PBS가 포함된 일치하는 유리 접시로 옮기고 PBS에서 10분 동안 절편을 두 번 세척합니다.

그런 다음 3% 과산화수소에서 20분 동안 배양합니다. 세척 후 세 가지 염산 용액을 통해 섹션을 이동합니다. 그런 다음 실온에서 0.1몰 사붕산나트륨에 20분 동안 중화합니다.

세척 완충액의 교체에서 10분 동안 3회 배양한 후, 실온에서 1시간 동안 절편을 차단 용액으로 옮깁니다. 그런 다음 절단본을 체포 4도에서 48시간 동안 차단 용액에 1 내지 100 희석한 마우스 항-BrdU에서 배양합니다.

1차 항체 배양 후, 세척 완충액에서 각각 10분 동안 3회 세척한 후, 세척 완충액에서 1 내지 10으로 희석한 양 고추냉이 과산화효소에서 48시간 동안 배양한다. 48시간 후, 절편을 PBS로 10분 동안 옮기고, 총 5회 세척을 반복한다. 세척 후 절편을 DAB 용액에 7분 동안 옮깁니다. 그런 다음 0.02% 과산화수소를 함유한 DAB 용액에 10분 동안 옮깁니다.

일련의 세척 후 현미경 슬라이드에 숫자 순서로 섹션을 장착합니다. 약 30분 동안 건조시킵니다. 그런 다