형광 현미경을 사용한 Drosophila Pupal Eye의 라이브 이미징

눈이 노출된 형질전환 초파리 번데기로 시작하십시오.

젤리

링으로 둘러싸인 수화된 종이 프레임 안의 젤리 구슬 위에 번데기를 놓습니다.

번데기의 눈에는 발달 중인 눈의 신경 상피에서 세포 경계를 강조하는 GFP 태그 접합 단백질이 포함되어 있습니다.

커버슬립을 번데기 눈 부위에 부드럽게 누릅니다.

형광 현미경에서 GFP 태그가 붙은 접합부는 형광을 발하여 신경상피 조직을 나타냅니다.

다양한 깊이에 걸쳐 일정한 간격으로 이미지를 촬영하고 이미지를 처리하여 대비를 높이고 배경 노이즈를 최소화합니다.

발달 중인 신경상피를 추적하기 위해 증가하는 시간 간격으로 이러한 이미지를 정렬합니다.

처음에 일차 세포는 광수용체 세포 클러스터 주위에 경계를 형성하는 반면, interommatidial 세포 또는 IC는 단일 층으로 배열됩니다.

나중에 IC는 광수용체 근처에서 2차 및 3차 세포로 분화합니다.

마지막으로, 과도한 IC는 프로그래밍된 세포 사멸을 통해 제거되어 조직화된 눈을 구조화하는 육각형 격자를 형성합니다.

겸자를 사용하여 개구를 조심스럽게 들어 올려 제거하여 번데기 머리를 노출시킵니다. 다음으로 번데기 케이스의 측면을 따라 찢어 한쪽 눈 주위를 노출시킵니다. 접착 테이프에서 번데기를 부드럽게 제거합니다.

압지로 작은 15제곱밀리미터 프레임을 만들고 중간에 5밀리미터 구멍을 뚫습니다. 프레임을 증류수에 담그고 현미경 슬라이드 중앙에 놓습니다. 30cc 주사기를 사용하여 균일한 바셀린 링을 짜내어 압지 프레임을 감쌉니다.

그런 다음 작은 바셀린 구슬을 슬라이드에 직접 추가합니다. 번데기를 조심스럽게 옆으로 눕히고 바셀린 구슬로 지지합니다. 바셀린 링 위에 커버슬립을 놓아 눈 위의 상피에 닿도록 합니다. 제제를 부드럽게 압축하여 커버슬립을 바셀린에 밀봉하고 동공 눈 영역과 커버슬립 사이에 작고 평평한 접촉면을 생성합니다.

형광 현미경을 사용하여 번데기 준비를 이미지화합니다. 7분마다 부착 접합부 영역에서 눈 신경상피의 정점 영역을 통해 일련의 절편을 캡처합니다. 적절한 디콘볼루션 소프트웨어를 사용하여 배경을 줄이고 직렬 단면 이미지의 대비를 향상시킵니다.

LAS AF 소프트웨어의 각 z 스택 파일에 대해 도구 패널로 이동하여 3D 디콘볼루션을 선택한 다음 적용을 클릭합니다. 각 디콘볼루션 스택 파일에 대해 최대 투영 또는 MP 이미지를 생성합니다. Photoshop CS5에 내장된 알고리즘을 사용하여 각 MP 이미지를 정렬하여 개별 세포 동