Visualizing Astrocyte Morphology Using Fluorescent Dye Iontophoresis in a Fixed Mouse Brain Slice

JoVE Encyclopedia of Experiments

신경과학

0 조회수 • 4:19 분 • May 29th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

화학적으로 고정된 마우스 뇌 조각을 완충액이 들어 있는 유리 바닥 접시에 넣고 메쉬로 고정합니다.

음이온성, 친수성 형광 염료로 채워진 전극을 전압 소스에 연결합니다.

접지 전극을 버퍼에 삽입하여 전기 회로를 완성합니다.

명시야 조명을 사용하여 염료로 채워진 전극을 슬라이스 쪽으로 전진시킵니다.

성상세포를 찾기 위해 적외선 미분 간섭 조영 영상으로 전환하십시오.

세포질에 접근하기 위해 전극으로 성상세포 체세포를 뚫습니다.

전류를 가하여 이온영동을 통해 염료를 세포질로 몰아넣습니다.

염료 움직임을 모니터링하기 위해 공초점 현미경으로 전환합니다.

소수성 막을 통과할 수 없는 친수성 염료는 세포질 내에서 확산되어 체세포와 가지를 채웁니다.

셀이 채워지면 전류를 멈추고 전극을 빼냅니다.

성상세포막이 다시 밀봉되도록 합니다.

다양한 Z-평면에서 이미지를 획득하고 이를 재구성하여 성상세포 형태를 시각화합니다.

염료 주입 시험을 위해 실온에서 0.1몰 PBS로 채워진 유리 바닥 접시에 가볍게 고정된 뇌 조각을 부드럽게 넣습니다. 그리고 나일론 현이 달린 백금 하프로 슬라이스를 제자리에 고정합니다.

전극을 전압에 연결하고 접지 전극을 뇌 슬라이스가 포함된 욕조에 넣습니다. 공초점 현미경의 대물렌즈를 관심 있는 뇌 영역으로 이동합니다.

그리고 10x 수침 렌즈를 사용하여 전극을 용액 속으로 낮추고 전극을 시야 중앙으로 이동합니다. 그런 다음 밝은 필드에서 전극을 슬라이스 쪽으로 천천히 낮추고 표면 바로 위에서 멈춥니다.

관심 있는 성상세포를 이온영동으로 채우려면 적외선 미분 간섭 대비를 사용하여 직경이 약 10마이크로미터, 슬라이스 표면 아래 40-50마이크로미터에 있는 길쭉한 타원형 체세포를 가진 성상세포를 식별합니다.

이것은 피라미드 세포층 바로 아래에 있는 해마의 방사층입니다. 조직을 통과하면서 혈관, 뉴런, 성상세포 및 기타 세포 유형을 볼 수 있습니다.

성상세포가 선택되면 세포를 시야의 중앙으로 이동하고 전극 끝을 슬라이스 안으로 천천히 내립니다. 전극이 세포체와 같은 평면에 있을 때까지 조직을 탐색합니다.

성상세포의 세포체가 명확하게 보이고 윤곽이 그려지면 전극을 천천히 부드럽게 앞으로 전진시키면서 끝이 세포의 체세포를 꿰뚫을 때까지 전극을 움직입니다.

대물렌즈의 초점을 천천히 위아래로 움직여 전극이 체마 내부에 있는지 확인합니다. 전극 팁이 셀 내부에 들어가면 자극기를 0.5-1볼트로 켜서 셀에 전류를 지속적으로 방출합니다.

공초점 현미경을 사용하여 세포가 채워지는 것을 관찰하고 디지털 줌을 증가시켜 세포의 세부 사항을 시각화하고 필요에 따라 전극 끝이 세포 내부에 보이는지 확인합니다.

전압을 끄고 전극 팁을 셀에서 부드럽게 빼내기 전에 더 미세한 가지와 프로세스가 정의될 때까지 약 15분 동안 기다리십시오.

채워진 세포를 이미지화하려면 세포가 원래 형태로 돌아올 때까지 15-20분 정도 기다린 후 공초점 현미경의 설정을 조정하여 40x 대물렌즈 아래에 정의된 더 미세한 가지와 과정이 나타나는지 확인합니다.

0.3마이크로미터의 스텝 크기로 z-스택을 설정하고 셀에서 신호가 없을 때까지 이미징하는 동안 대물렌즈를 이동합니다. 그리고 그 단계를 맨 위로 설정하세요.

그런 다음 대물렌즈를 아래로 이동하여 신호가 없을 때까지 셀을 통해 초점을 맞춥니다. 그리고 그 단계를 바닥으로 설정하세요.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026