마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입 시각화(Visualization of Calcium Influx in Ventral Midbrain Neurons derived from Mouse Embryos)

마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런 배양이 포함된 커버슬립을 가져 가십시오.

세포는 칼슘 지표를 발현하기 위해 바이러스 벡터에 감염됩니다.

커버슬립을 기록 완충액으로 관류된 공초점 현미경의 기록 챔버로 옮깁니다.

가시광선을 사용하여 여러 뉴런이 포함된 영역을 식별한 다음 형광 이미징으로 전환합니다.

낮은 세포내 칼슘 수치에서 지시약은 결합되지 않은 상태로 유지되어 낮은 형광 강도를 나타냅니다.

뉴런의 고유한 특성은 자발적인 활동 전위를 생성하여 전압 개폐 칼슘 채널을 열고 칼슘 유입을 허용합니다.

과도한 칼슘은 지시약에 결합하여 형광 강도를 증가시키는 구조적 변화를 유도합니다.

자발적인 칼슘 활성을 추적하기 위해 시간 경과에 따른 형광 강도를 기록합니다.

뉴런의 수용체에 결합하여 지속적인 활동 전위를 생성하는 고농도의 신경 전달 물질을 도입합니다.

지속적인 전압 개폐 칼슘 채널 활성화는 칼슘 유입을 연장하여 형광 강도의 지속적인 증가를 유발합니다.

고 지시에 따라 HEPES 기록 완충액 1리터, 20몰 글루타메이트 기록 완충액 200밀리리터, 10마이크로몰 NBQX 기록 완충액 200밀리리터를 준비합니다. 멸균 밀리미터 페트리 접시에 3밀리리터의 기록 완충액을 채웁니다.

인큐베이터에서 감염된 배양물이 담긴 페트리 접시를 가져온 다음 가는 끝 집게로 커버슬립 하나의 가장자리를 조심스럽게 잡고 기록 완충액이 있는 접시로 옮깁니다. 배지에 남은 커버슬립을 섭씨 37도 인큐베이터에 다시 넣고 기록 완충액이 있는 접시를 공초점 현미경으로 운반합니다.

이미징 소프트웨어를 시작합니다. 초기화하는 동안 연동 펌프를 시작하고 라인을 기록 버퍼에 넣습니다. 그런 다음 유량을 분당 2밀리리터로 보정합니다. 미세한 집게를 사용하여 페트리 접시에서 기록조로 감염된 커버슬립을 옮깁니다. 10x 수침 대물렌즈와 명시야광을 사용하여 초점면을 찾고 뉴런 세포체의 밀도가 높은 영역을 찾습니다. 그런 다음 40X 대물렌즈로 전환하고 샘플에 다시 초점을 맞춥니다.

염료 목록 창에서 Alexa Flour 488을 선택하고 적용합니다. 형광단의 과다 노출 및 광표백을 방지하려면 낮은 HV 및 레이저 출력 설정으로 시작하십시오. Alexa Fluor 488 채널의 경우 HV를 500으로, 게인을 1x로, 오프셋을 0으로 설정합니다. 488 레이저 라인의 출력을 5%로 설정하고, 핀홀 크기를 300마이크로미터로 늘리고, 초점 x2 스캐닝 옵션을 사용하여 방출 신호를 포화 수준 이하로 최적으로 조정합니다.

그런 다음 각 채널의 최적 가시성을 위해 설정을 조정할 수 있습니다. 현미경 설정이 최적화되면 스테이지를 이동하여 GCaMP6f 형광의 자발적인 변화를 나타내는 여러 세포가 있는 영역을 찾고 이미징을 위해 원하는 평면에 초점을 맞춥니다. 클립 사각형 도구를 사용하여 1초 미만의 프레임 간격을 달성할 수 있는 크기로 이미징 프레임을 클리핑합니다. 간격 창을 1.0 값으로 설정하고 숫자 창을 600으로 설정합니다.

t-시리즈 동영상을 캡처하려면 시간 옵션을 선택한 다음 XYt 스캔 옵션을 사용하여 이미징을 시작합니다. 이미징 진행률 표시줄을 보고 적절한 시점에서 HEPES 기록 완충액에서 20마이크로몰 글루타메이트 기록 완충액으로 라인을 이동합니다. 이미징이 완료되면 시리즈 완료 버튼을 선택하고 완성된 T-시리즈 동영상을 저장합니다. 배양된 뉴런이 총 10분 동안 글루타메이트에 노출되도록 추가로 5분 동안 글루타메이트를 계속 관류합니다.

이미지화할 각 커버슬립에 대해 이 과정을 반복합니다. 실험 직후 신경 세포체에서 미량의 칼슘을 볼 수 있습니다. 타원 도구를 사용하여 신경 체세포 주위에 원하는 수의 ROI를 그리고 시리즈 분석 버튼을 사용하여 흔적을 시각화합니다. 글루타메이트에 추가로 5분 노출된 후, 미세한 집게로 수조에서 커버슬립을 제거하고 모든 이미징이 완료될 때까지 기록 완충액이 있는 페트리 접시에 다시 넣습니다.