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신경과학
0 조회수 • 3:41 분 • May 29th, 2025
젊은 뉴런을 나타내는 단기 쥐 해마 뉴런 배양과 노화된 뉴런을 나타내는 장기 배양을 예로 들어 보겠습니다.
노화된 뉴런은 더 높은 밀도의 L형 전압 개폐 칼슘 채널 또는 L-VGCC를 나타내며, 이는 막 탈분극 시 더 오랜 기간 동안 열린 상태로 유지됩니다.
세포 내로 확산되는 형광 칼슘 지시약과 함께 배양한 다음 세척하여 과도한 염료를 제거합니다.
배양물을 형광 현미경 아래 관류 챔버에 넣습니다.
뉴런의 수용체에 결합하여 나트륨 이온의 유입을 유도하고 막 탈분극을 유발하는 신경 전달 물질을 포함하는 용액을 도입합니다.
탈분극은 L-VGCC를 활성화하여 세포질로의 칼슘 유입을 가능하게 합니다.
장기 배양에서 L-VGCC의 밀도가 높아지고 개방이 길어지면 신경 노화의 특징인 칼슘 과부하가 발생합니다.
지시약에 칼슘 결합은 형광을 생성하며, 노화된 뉴런은 더 높은 형광 강도를 나타내며 자극 시 증가된 세포내 칼슘 수치를 반영합니다.
이 절차에서는 세포를 Fura2-AM과 함께 어두운 실온에서 60분 동안 배양한 다음 커버슬립을 관류 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 커버슬립이 있는 관류 챔버를 도립 현미경의 홀더에 놓습니다. 현미경 필드를 선택하고 예열된 HBS로 세포를 지속적으로 관류합니다.
그 후, 궁극적으로 340 및 380 나노 미터에서 세포를 에피 조명한 다음 Fura-2 이색성 거울로 필터링 된 형광 카메라로 520 나노 미터에서 방출되는 빛을 5-10 초마다 기록합니다. 기록된 형광 이미지를 분석합니다. 먼저 실험 파일을 엽니다.
AquaCosmos 소프트웨어를 사용하여 비율을 클릭하고 원하는 비율 범위를 선택합니다. 일련의 비율 이미지를 얻기 위해 결과 이미지에서 픽셀 단위 비율을 계산합니다. 그런 다음 배경 조명 버튼을 조정하여 배경을 뺍니다. 그런 다음 계산 시작을 누릅니다. 그런 다음 모든 시간 시퀀스 버튼을 누르고 고대 ROI를 지웁니다.
개별 세포의 정량적 분석을 위해 새로운 ROI 또는 개별 뉴런에 해당하는 ROI를 설정합니다. 개별 기록을 그래프로 표시하려면 그래프를 클릭하여 각 ROI에 해당하는 비율 형광 값을 원본 실험실 프로그램으로 내보냅니다. 그런 다음 계산을 클릭하고 TXT 파일을 저장합니다. 그 후, 각 자극에 대한 반응으로 형광 비율의 상승 크기를 추정하기 위해 해당 계산을 수행합니다.