쥐 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 3차원 시각화

0 조회수6:41 • May 29th, 2025

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광견병 바이러스에 감염된 쥐로부터 고정된 두꺼운 뇌 절편을 채취합니다.

바이러스는 뉴런을 감염시키고 복제하여 세포 내에 존재하는 바이러스 단백질을 생성합니다.

세포막을 투과화하는 세제와 비특이적 결합 부위를 마스킹하는 차단 용액으로 처리합니다.

바이러스 단백질을 표적으로 하는 1차 항체와 배양한 다음 1차 항체에 결합하는 형광단 접합 2차 항체와 배양합니다.

형광 핵산 결합 염료로 처리하여 핵을 표지합니다.

알코올 농도를 증가시켜 조직을 탈수한 다음 투명 용액을 적용하여 이미징을 위한 조직 투명도를 높입니다.

이미징 챔버에 섹션을 장착하고 투명 용액으로 채우고 밀봉합니다.

공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 형광 라벨을 사용하여 조직을 별도로 이미지화한 다음 병합하여 2차원 이미지를 만듭니다.

조직 전체의 다양한 초점면에서 이미지를 획득하고 이를 결합하여 감염 진행을 평가하기 위한 3차원 표현을 생성합니다.

뇌 조직 절편의 면역염색을 위해, PBS에서 0.2% Triton X-100 4밀리리터에서 1시간 동안 샘플을 2회 세척한 후, 섭씨 37도에서 2일 동안 0.2% Triton X-100, 20% 디메틸설폭사이드 및 PBS에서 0.3몰 글리신으로 2일 동안 투과화합니다. 섭씨 37도에서 2일 동안 PBS에서 0.2% Triton X-100, 10% 디메틸설폭사이드 및 6% 정상 혈청 4밀리리터로 비특이적 결합을 차단합니다.

차단 배양이 끝나면 섭씨 37도에서 5일 동안 2밀리리터의 1차 항체 용액으로 샘플을 라벨링하고 2일 반 후에 항체 용액을 새로 고칩니다. 다음으로, PBS에서 헤파린 밀리리터당 0.2% 트윈 20 및 10마이크로그램의 4밀리리터로 샘플을 하루 동안 세척하고, 하루 동안 세척 완충액을 최소 4-5회 교환하고 최종 세척을 밤새 그대로 둡니다.

다음날 샘플을 섭씨 37도에서 5일 동안 2밀리리터의 2차 항체 용액에 배양합니다. 그런 다음 시연된 대로 PBS에서 신선한 0.2% 트윈 20 및 10마이크로그램의 신선한 0.2% 트윈 20 및 10마이크로그램으로 샘플을 세척합니다.

샘플의 핵 염색을 위해 샘플을 4밀리리터의 핵산 염색 TO-PRO-3에 5시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 배양이 끝나면 시연된 바와 같이 PBS에서 헤파린 밀리리터당 0.2% 트윈 20 및 10마이크로그램으로 샘플을 세척한 다음 오름차순 tert-부탄올 계열에서 침지당 2시간 동안 탈수합니다.

90% 침지 후 샘플을 밤새 96% tert-부탄올 용액에 옮깁니다. 다음날 아침, 샘플을 100% tert-부탄올에서 2시간 동안 더 탈수한 후 광학적으로 투명해질 때까지 새로 준비된 BABB-D15에서 조직 절편을 2-6시간 동안 제거합니다. 그런 다음 샘플을 BABB-D15에 저장할 수 있으며, 장착 및 이미징 될 때까지 빛으로부터 보호됩니다.

샘플 장착의 경우 3D 프린터를 사용하여 이미징 챔버와 뚜껑을 인쇄합니다. 직경 30mm의 커버슬립을 하나의 구성 요소 실온 가황 실리콘 고무로 이미징 챔버에 장착합니다. 마찬가지로 뚜껑에 22mm 커버슬립을 장착합니다. 고무가 밤새 경화되도록 하기 전에 물에 적신 면봉을 사용하여 양쪽 링의 과도한 실리콘 고무를 제거합니다.

다음날 샘플을 이미징 챔버에 넣고 뚜껑을 삽입하기 전에 챔버에 소량의 BABB-D15를 추가합니다. 피하 주사 바늘을 사용하여 입구를 통해 챔버를 BABB-D15로 채우고 이미징 챔버를 실리콘 고무로 밀봉하기 전에 입구를 막습니다.

이미지 획득을 설정하려면 사용된 형광단에 적합한 레이저 라인을 선택하고 각 검출기의 검출 범위를 조정하여 채널 간의 신호 중첩을 방지합니다. 그런 다음 획득 매개변수를 설정하고, 스택의 상단 및 하단 테두리를 정의하고, 이미지 스택을 획득합니다.

이미지 스택의 3D 투영을 생성하려면 피지에서 이미지 파일을 열고 이미지, 색상, 채널 도구, 더보기 및 채널 분할을 선택하여 병합된 이미지를 개별 채널로 분할합니다. 각 채널에 대한 이미지의 표백 보정을 위해 이미지(Image), 조정(Adjust), 표백 보정(Bleach Correction)을 선택하고 단순 비율(Simple ratio)을 선택합니다. 슬라이더를 사용하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정하고 이미지, 색상 및 채널 병합을 선택합니다. 컴포지트 생성 옵션을 선택합니다.

이미지를 RGB 형식으로 변환하고 이미지, 스택 및 3D 프로젝트를 선택하여 3D 프로젝션을 생성합니다. 투영 방법으로 가장 밝은 점을 선택하고 획득한 이미지 스택의 Z-스텝 크기와 일치하도록 슬라이스 간격을 설정합니다. 최대 품질을 위해 회전 각도 증분을 1로 설정하고 보간을 활성화합니다. 필요에 따라 총 회전, 투명도 임계값 및 불투명도를 수정합니다. 그런 다음 3D 투영을 둘 다로 저장합니다. TIFF 및 .AVI 파일 형식.

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마지막 업데이트: 1 8월 2026