쥐 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 3차원 시각화

광견병 바이러스에 감염된 쥐로부터 고정된 두꺼운 뇌 절편을 채취합니다.

바이러스는 뉴런을 감염시키고 복제하여 세포 내에 존재하는 바이러스 단백질을 생성합니다.

세포막을 투과화하는 세제와 비특이적 결합 부위를 마스킹하는 차단 용액으로 처리합니다.

바이러스 단백질을 표적으로 하는 1차 항체와 배양한 다음 1차 항체에 결합하는 형광단 접합 2차 항체와 배양합니다.

형광 핵산 결합 염료로 처리하여 핵을 표지합니다.

알코올 농도를 증가시켜 조직을 탈수한 다음 투명 용액을 적용하여 이미징을 위한 조직 투명도를 높입니다.

이미징 챔버에 섹션을 장착하고 투명 용액으로 채우고 밀봉합니다.

공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 형광 라벨을 사용하여 조직을 별도로 이미지화한 다음 병합하여 2차원 이미지를 만듭니다.

조직 전체의 다양한 초점면에서 이미지를 획득하고 이를 결합하여 감염 진행을 평가하기 위한 3차원 표현을 생성합니다.

뇌 조직 절편의 면역염색을 위해, PBS에서 0.2% Triton X-100 4밀리리터에서 1시간 동안 샘플을 2회 세척한 후, 섭씨 37도에서 2일 동안 0.2% Triton X-100, 20% 디메틸설폭사이드 및 PBS에서 0.3몰 글리신으로 2일 동안 투과화합니다. 섭씨 37도에서 2일 동안 PBS에서 0.2% Triton X-100, 10% 디메틸설폭사이드 및 6% 정상 혈청 4밀리리터로 비특이적 결합을 차단합니다.

차단 배양이 끝나면 섭씨 37도에서 5일 동안 2밀리리터의 1차 항체 용액으로 샘플을 라벨링하고 2일 반 후에 항체 용액을 새로 고칩니다. 다음으로, PBS에서 헤파린 밀리리터당 0.2% 트윈 20 및 10마이크로그램의 4밀리리터로 샘플을 하루 동안 세척하고, 하루 동안 세척 완충액을 최소 4-5회 교환하고 최종 세척을 밤새 그대로 둡니다.

다음날 샘플을 섭씨 37도에서 5일 동안 2밀리리터의 2차 항체 용액에 배양합니다. 그런 다음 시연된 대로 PBS에서 신선한 0.2% 트윈 20 및 10마이크로그램의 신선한 0.2% 트윈 20 및 10마이크로그램으로 샘플을 세척합니다.

샘플의 핵 염색을 위해 샘플을 4밀리리터의 핵산 염색 TO-PRO-3에 5시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 배양이 끝나면 시연된 바와 같이 PBS에서 헤파린 밀리리터당 0.2% 트윈 20 및 10마이크로그램으로 샘플을 세척한 다음 오름차순 tert-부탄올 계열에서 침지당 2시간 동안 탈수합니다.

90% 침지 후 샘플을 밤새 96