광시트 형광 현미경을 사용한 운동 뉴런 투영 및 축삭 분지 시각화

척수 운동 뉴런에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 형질전환 마우스 배아에서 화학적으로 고정되고 제거된 조직 부분을 채취합니다.

수정된 피펫 팁에 조직을 수직으로 장착합니다.

라이트 시트 형광 현미경 내에 고정된 모세관에 팁을 부착합니다.

조직 아래에 완충액으로 채워진 샘플 챔버를 놓아 조직을 담그고 잔해물을 제거합니다.

이미징 소프트웨어를 사용하여 광 경로에 조직을 정렬합니다.

이미지 획득을 시작합니다.

광원은 얇은 레이저 광 시트를 방출하여 조직의 단일 평면에서 GFP를 자극하여 형광을 방출합니다.

광 경로에 수직으로 배치된 검출기는 방출된 형광을 포착합니다.

척추 운동 뉴런의 이미지를 획득하여 축삭 분지 형태의 3D 재구성을 생성합니다.

소프트웨어를 사용하여 축삭을 매핑하고 분기 패턴과 종점을 식별하여 운동 뉴런 성장과 연결성을 평가합니다.

5X/0.1 조명 광학 및 5X/0.16 감지 광학 장치를 설정합니다. 샘플 홀더와 샘플 모세관을 조립합니다. 샘플 챔버를 투명 용액으로 채워 준비합니다. 배아를 장착하려면 모세관의 직경에 맞도록 윗부분을 잘라내어 P200 피펫 팁을 준비하고 샘플 부착을 위해 뾰족한 부분을 제거합니다.

그런 다음 작은 불꽃을 사용하여 피펫 팁의 무딘 끝을 녹입니다. 불을 끄고 녹은 끝에 배아를 수직으로 빠르게 부착합니다. 피펫 팁의 윗부분을 샘플 모세관에 끼우고 준비된 샘플 챔버를 현미경에 넣습니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 Locate 탭에서 Locate Capillary를 선택하고 xy 및 z축을 조정합니다.

그런 다음 샘플 찾기를 선택하고 0.6X로 확대하여 배아에 초점을 맞춥니다. 잔해물이나 기포를 제거하기 위해 챔버 완충액이 배아와 일정 시간 동안 평형을 이루도록 합니다. 획득 탭에서 이미지 획득의 경우 감지 대물렌즈, 레이저 차단 필터, 빔 스플리터, 카메라 및 레이저와 같은 광경로 매개변수를 정의합니다.

피벗 스캔 확인란에서 그림자 감소를 선택합니다. 그런 다음 획득 설정, 비트 심도를 16비트로 정의합니다. 0.36배에서 0.7배 사이의 단면 조명 또는 양면 조명 사이로 확대합니다. 연속을 클릭하고 레이저 강도, 노출 시간, 레이저 출력 및 라이트 시트 위치를 설정합니다. 그런 다음 중지를 눌러 이미지 획득을 종료합니다.

개별 운동 신경의 미세한 직립 구조의 이미지를 자세히 획득할 수 있도록 투명 샘플이 최단 광경로 내에 위치하는지 확인하는 것이 중요합니다.

다차원 획득의 경우 첫 번