광시트 형광 현미경을 사용한 운동 뉴런 투영 및 축삭 분지 시각화

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신경과학

0 조회수 • 5:40 분 • May 29th, 2025

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척수 운동 뉴런에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 형질전환 마우스 배아에서 화학적으로 고정되고 제거된 조직 부분을 채취합니다.

수정된 피펫 팁에 조직을 수직으로 장착합니다.

라이트 시트 형광 현미경 내에 고정된 모세관에 팁을 부착합니다.

조직 아래에 완충액으로 채워진 샘플 챔버를 놓아 조직을 담그고 잔해물을 제거합니다.

이미징 소프트웨어를 사용하여 광 경로에 조직을 정렬합니다.

이미지 획득을 시작합니다.

광원은 얇은 레이저 광 시트를 방출하여 조직의 단일 평면에서 GFP를 자극하여 형광을 방출합니다.

광 경로에 수직으로 배치된 검출기는 방출된 형광을 포착합니다.

척추 운동 뉴런의 이미지를 획득하여 축삭 분지 형태의 3D 재구성을 생성합니다.

소프트웨어를 사용하여 축삭을 매핑하고 분기 패턴과 종점을 식별하여 운동 뉴런 성장과 연결성을 평가합니다.

5X/0.1 조명 광학 및 5X/0.16 감지 광학 장치를 설정합니다. 샘플 홀더와 샘플 모세관을 조립합니다. 샘플 챔버를 투명 용액으로 채워 준비합니다. 배아를 장착하려면 모세관의 직경에 맞도록 윗부분을 잘라내어 P200 피펫 팁을 준비하고 샘플 부착을 위해 뾰족한 부분을 제거합니다.

그런 다음 작은 불꽃을 사용하여 피펫 팁의 무딘 끝을 녹입니다. 불을 끄고 녹은 끝에 배아를 수직으로 빠르게 부착합니다. 피펫 팁의 윗부분을 샘플 모세관에 끼우고 준비된 샘플 챔버를 현미경에 넣습니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 Locate 탭에서 Locate Capillary를 선택하고 xy 및 z축을 조정합니다.

그런 다음 샘플 찾기를 선택하고 0.6X로 확대하여 배아에 초점을 맞춥니다. 잔해물이나 기포를 제거하기 위해 챔버 완충액이 배아와 일정 시간 동안 평형을 이루도록 합니다. 획득 탭에서 이미지 획득의 경우 감지 대물렌즈, 레이저 차단 필터, 빔 스플리터, 카메라 및 레이저와 같은 광경로 매개변수를 정의합니다.

피벗 스캔 확인란에서 그림자 감소를 선택합니다. 그런 다음 획득 설정, 비트 심도를 16비트로 정의합니다. 0.36배에서 0.7배 사이의 단면 조명 또는 양면 조명 사이로 확대합니다. 연속을 클릭하고 레이저 강도, 노출 시간, 레이저 출력 및 라이트 시트 위치를 설정합니다. 그런 다음 중지를 눌러 이미지 획득을 종료합니다.

개별 운동 신경의 미세한 직립 구조의 이미지를 자세히 획득할 수 있도록 투명 샘플이 최단 광경로 내에 위치하는지 확인하는 것이 중요합니다.

다차원 획득의 경우 첫 번째 이미지와 마지막 이미지의 Z 위치를 이동하여 Z 스택을 정의합니다. 최적을 클릭하여 슬라이스 번호를 설정합니다. 그런 다음 실험 시작을 클릭하여 선택한 Z 스택을 획득합니다. 완료되면 이미지를 도트 CZI 형식으로 저장합니다.

축삭 수목화를 정량화하려면 이미징 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 엽니다. 디스플레이 조정 창을 사용하여 이미지 색상, 밝기 및 대비를 조정하여 로컬 강도 대비를 기반으로 필라멘트를 감지합니다. 그런 다음 새 필라멘트 추가 아이콘을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 자동 경로 알고리즘을 선택합니다. 관심 지역을 선택합니다.

그런 다음 슬라이스 모드를 사용하여 측정할 수 있는 가장 큰 직경과 가장 얇은 직경 측정값을 할당하여 시작 지점과 시드점을 정의합니다. 관심 영역의 가장자리에 시작점을 지정합니다. 시작점을 수동으로 추가하거나 제거하려면 먼저 포인터 모드를 변경하고 선택을 탐색한 다음 관심 지점을 이동하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭합니다.

그런 다음 시드 포인트에 대한 수동 임계값을 선택하여 보이는 모든 수목이 표시되었는지 확인합니다. 그런 다음 시드 포인트를 수동으로 추가하거나 제거합니다. 연결이 끊긴 세그먼트 제거 확인란을 선택하고 시작점 주변의 시드 점을 제거합니다. 그런 다음 배경 빼기 임계값을 조정하고 프로세스를 완료합니다.

정확한 정량화를 위해서는 배경 아티팩트를 제거하고 검출기 경로가 진정한 축삭 수목화를 반영하는지 확인해야 합니다.

마지막으로 원하는 스타일과 색상을 선택하십시오. 통계 탭에서 세부 정보를 선택하고 필라멘트 번호 수상돌기 단점을 사용하여 운동 축삭 수목화의 지표로서 운동 신경 말단을 정량화합니다. 그런 다음 재구성된 축삭의 이미지를 . TIFF 파일.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026