0 조회수 • 4:38 분 • May 29th, 2025
마우스 좌골 신경 및 후근 신경절 또는 DRG에서 분리된 세포를 채취합니다.
CD45 및 CD11b에 대한 형광단 태그 항체 및 MHC 클래스 II에 대한 비오틴 태그 항체와 함께 배양하여 면역 세포를 표지합니다.
비오틴에 결합하는 형광단 태그가 부착된 스트렙타비딘과 함께 배양합니다.
세포 구조를 안정화시키기 위해 고정제로 치료하십시오.
형광 DNA 염색제가 있는 투과화 완충액을 도입하여 막을 투과화하고 핵을 표지합니다.
유세포 분석기를 사용하여 레이저 빔을 통해 세포를 통과시켜 광학 및 형광 특성을 평가합니다.
DNA 형광이 더 높은 응집체를 제거하여 단일 세포를 분리하고 마커에서 형광을 검출합니다.
면역 세포의 특징적인 마커인 CD45를 발현하는 세포를 식별하여 그 존재를 확인합니다.
DRG에서 대부분의 CD45 양성 세포는 CD11b 및 MHC 클래스 II를 발현하며, 이는 좌골 신경에 없는 미세아교세포 유사 세포를 나타냅니다.
이 기술은 신경 조직 내 면역 세포 이질성을 분석하기 위한 이미징을 보완합니다.
컴퓨터에서 관심 형광단 검출을 위한 적절한 채널, 샘플에 대한 적절한 유속 및 샘플당 수집할 총 이벤트 수를 선택합니다. 최소 이벤트 수는 100만 개여야 합니다.
다음으로, 측면 산란 A 대 순방향 산란 A의 전역 워크시트 아래, 관심 있는 각 형광단 대 순방향 산란 A에 대한 산점도를 만듭니다. 또한 선택한 형광단에 대한 이벤트 수와 평균 형광 강도를 표시하는 통계 보기를 만듭니다.
DAPI 전용 염색 대조군의 산점도를 기반으로 모 게이트 P1을 결정합니다. 샘플을 유세포 분석에 부착하고 획득을 클릭합니다. DAPI 대 FSC 플롯을 관찰하고 DAPI-plus 모집단이 보일 때까지 DNA Pacific Blue 채널의 전압을 줄입니다. 직사각형 게이팅 도구를 사용하여 DAPI 플러스 모집단 주위에 상자를 그립니다. 이것은 P1 게이트를 나타냅니다. 각 형광단에 대한 산점도를 선택하고 DAPI-plus 이벤트만 표시합니다. 이것은 각 형광단에 대한 배경 형광을 나타냅니다.
직사각형 게이팅 도구를 사용하여 y축의 103에서 시작하여 각 형광단에 대한 산점도에 상자를 그립니다. 이 게이트는 명시된 각 마커에 대한 양성 이벤트가 발견되어야 하는 영역을 나타냅니다. DAPI 전용 염색 컨트롤을 사용하여 각 형광단에 대한 전압을 조정합니다. 샘플을 유세포 분석에 부착하고 획득을 클릭합니다.
각 형광단에 대한 DAPI-plus 모집단의 위치를 관찰하고 모집단이 직사각형 게이트 외부로 떨어지도록 각각의 전압을 조정합니다. 유세포 분석기가 설정되면 샘플을 실행하고 추가 분석을 위해 전방 산란 파일을 내보냅니다.