JoVE 실험 백과사전
신경과학
0 조회수 • 2:59 분 • May 29th, 2025
형질도입된 마우스 배아 기관형 뇌 절편이 포함된 멤브레인 삽입물을 가져 가는데, 여기서 뉴런과 방사형 신경교세포는 형광 단백질을 발현하여 시각화를 가능하게 합니다.
형광 현미경을 사용하여 손상되지 않은 방사형 신경교 스캐폴드를 사용하여 슬라이스의 연막 표면을 향해 방사형으로 이동하는 형광 피질 뉴런이 있는 슬라이스를 선택합니다.
선택한 슬라이스가 있는 멤브레인 인서트를 이미징 중 세포 활동을 지원하기 위해 배지가 있는 유리 바닥 접시로 옮깁니다.
세포 생존력을 보장하기 위해 접시를 도립 공초점 현미경의 온도 조절 챔버에 넣습니다.
이미징 매개변수를 조정하여 광손상을 최소화하면서 선명한 이미지를 캡처합니다.
다음으로, 세포 구조를 시각화하기 위해 대상 영역에서 Z-스택을 구성합니다.
일정한 간격으로 타임랩스 이미징을 시작합니다.
이미지를 분석하여 뇌실하 영역에서 방사형 신경교세포 스캐폴드를 따라 피질판을 향한 피질 뉴런의 방사형 이동을 평가하여 신경 이동 패턴을 강조합니다.
도립 현미경을 통해 절편을 관찰하여 이미징을 위한 뇌 절편을 선택합니다. 상부 SVZ에 밝은 단일 뉴런이 있는 슬라이스를 선택하고 슬라이스의 연막 표면을 향해 방사형으로 이동합니다.
전체 피질판에 걸쳐 있는 방사형 신경교세포의 미세한 형광 돌기의 존재는 이동하는 피질 뉴런에 의해 사용되는 온전한 방사형 신경교세포 스캐폴드를 나타냅니다.
선택한 슬라이스가 있는 멤브레인 인서트를 2밀리리터의 슬라이스 배양 배지가 들어 있는 직경 50밀리미터의 유리 바닥 접시로 옮깁니다. 접시를 공초점 현미경의 기후 챔버에 넣습니다.
해상도를 512 x 512 픽셀로 설정합니다. 스캔 속도를 400Hz에서 700Hz로 높여 프레임 속도를 초당 약 1.4프레임에서 약 2.5프레임으로 높입니다. 평균을 두 번 이상 사용하지 마십시오.
1.5미크론의 스텝 크기로 전기천공된 영역을 통해 Z-스택을 정의합니다. 30분마다 Z-스택을 가져와 타임랩스 시리즈를 시작합니다. 설명된 설정은 획득 중에 광손상을 낮게 유지하면서 이미지의 충분한 해상도와 밝기를 허용합니다.