컨포칼 현미경을 사용한 제브라피시 유충의 선택적 단일 뉴런 레이저 절제

척수 운동 뉴런에서 형광 단백질을 발현하는 마취된 형질전환 제브라피쉬 유충을 포함하는 예열된 아가로스 용액을 섭취하십시오.

충을 아가로스 링이 있는 유리 접시로 옮깁니다.

현미경을 사용하여 유충을 옆으로 눕힙니다. 그런 다음 아가로스가 응고되어 유충을 고정시킵니다.

마취를 유지하기 위해 마취제가 함유된 완충액을 첨가하십시오.

접시를 공초점 현미경 스테이지에 놓고 명시야 이미징을 사용하여 등쪽 척수 영역을 찾습니다.

형광 모드로 전환하여 형광 운동 뉴런을 시각화합니다

정확한 절제 타겟팅을 위해 세포 체마의 중심 z-평면을 결정합니다.

광손상을 최소화하면서 고해상도 획득을 위한 이미징 매개변수를 구성합니다.

원하는 z 평면에 초점이 맞춰지면 집속된 자외선 레이저를 사용하여 표적 뉴런 영역에 대한 절제를 수행합니다.

레이저 에너지는 세포 구조를 파괴하여 형광 손실과 세포 사멸을 유발합니다. 돌이킬 수 없는 형광 손실은 주변 세포에 영향을 주지 않고 정확한 절제를 확인합니다.

조정 가능한 피펫을 사용하여 유충을 끌어올려 팁 바닥으로 가라앉히십시오. 예열된 아가로스에 최소한의 액체에 유충을 떨어뜨린 다음 아가로스로 생선을 끌어올려 미리 준비된 유리 바닥 35mm 접시에 빠르게 분배합니다. 해부 현미경 아래에서 표준 붓을 사용하여 동물 또는 여러 동물을 옆으로 아가로스 안에 배치하여 몸과 꼬리가 평평하도록 합니다.

아가로스가 단단히 굳을 때까지 묻힌 물고기를 10-15분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 트리케인과 함께 약 2밀리리터의 계란물을 사용하여 35mm 페트리 접시를 조심스럽게 채웁니다. 유충이 내장된 페트리 접시를 공초점 현미경 스테이지에 놓고 명시야 조명과 40X 배율을 사용하여 동물 척수의 등쪽에 초점을 맞춥니다. 적절한 형광 설정으로 전환하고 관심 있는 구조를 시각화하여 모든 이미징 매개변수가 후속 절제에 필요한 것인지 확인합니다.

UV 레이저 절제를 위한 구조의 두께를 결정하려면 Z 드라이브를 사용하여 수동으로 위아래로 초점을 맞춰 관심 구조의 상단과 하단을 확인합니다. 예를 들어 셀의 중심과 같이 제거될 Z 평면을 수동으로 기록합니다. 레이저 절제를 수행하려면 소프트웨어 메뉴 상단의 드롭다운 메뉴를 클릭하여 FRAP 마법사를 시작합니다.

새 창에서 형식, 스캔 속도 및 평균화를 선택하여 절제 접근 방식에 대한 이미지 매개변수를 결정합니다. 절제를 위한 Z 평면이 아직 선택되지 않은 경우 라이브 버튼을 누르고 형광 구조 또는 절제할 원하는 Z 평면에 초점이 맞춰질 때까지 표본을 통해 초점을 맞춥니다. 일반 이미지 매개변수가 설정되면 표백 단계에 액세스하여 특정 절제 구성 요소를 제어한 다음 표백 절차를 위해 활성화하여 405나노미터 레이저를 사용합니다.

다음으로, 확대 옵션을 사용하여 스캔 필드를 줄여 선택한 ROI에서 표백 강도를 최대화하여 체류 시간을 최대화합니다. 이미지 획득 창의 그리기 도구를 사용하여 절제에 대해 하나 이상의 ROI를 선택합니다. 예를 들어 약 4-8마이크로미터의 원형 그리기 도구를 사용하여 축삭 언덕을 목표로 합니다.

ROI를 설정한 후 시간 경과 버튼을 선택하고 ROI를 스캔하고 제거할 주기 수를 확인합니다. 표백 과정 직전과 직후에 전체 이미지를 한눈에 볼 수 있도록 원하는 대로 표백 전 및 표백 후 프레임을 선택합니다.

이러한 설정을 통해 연구자는 여러 계층의 개선을 수행할 수 있습니다. 레이저 출력, 스캔 속도, 라인 평균화, 관심 영역의 크기 및 반복 조정을 통해 이 기술은 개별 세포에 스트레스나 죽음을 유발할 수 있는 높은 자유도를 제공합니다.

필요한 모든 절제 매개변수를 설정한 후 실험 실행을 누르고 절제 효율성을 모니터링합니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.