0 조회수 • 3:16 분 • May 29th, 2025
소돌기아교세포로 분화하도록 유도된 쥐 새끼 뇌에서 분리된 희소돌기아교세포 전구체 세포(OPC)를 배양합니다. 세포는 세포 구조를 보존하기 위해 고정되어 있습니다.
분화된 희소돌기아교세포는 성숙한 희소돌기아교세포의 마커인 미엘린 염기성 단백질(MBP)을 발현하는 반면, OPC와 분화된 세포 모두 희소돌기아교세포 전사 인자 2 또는 Olig2를 발현합니다.
투과화 차단 용액을 바르고 교반하여 세포막을 투과화하고 비특이적 결합 부위를 차단하면서 배양합니다.
마커를 표적으로 하는 1차 항체를 추가하고 교반과 함께 배양하여 결합을 허용합니다.
결합되지 않은 항체를 세척하여 제거한 다음 1차 항체에 특이적인 다른 형광단 접합 2차 항체를 추가하고 교반하면서 배양합니다.
세포를 세척한 다음 이중 형광 이미징 시스템에 넣습니다.
특정 파장의 빛을 사용하여 뚜렷한 형광단을 여기시키고 방출된 신호를 감지하여 마커를 시각화합니다.
olig2만을 발현하는 미분화 OPC 중에서 olig2 및 MBP를 발현하는 분화된 희소돌기아교세포를 식별합니다.
접시를 실온으로 가져옵니다. 웰을 흡인하고 5% NGS 및 0.1% Triton X-100을 함유한 250마이크로리터의 DPBS를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 안와를 흔들면서 배양합니다. 5% NGS를 함유한 DPBS에서 마우스 단클론 항-MBP 항체 및 토끼 다클론 항-OLIG2 항체를 희석하여 1차 배양 용액을 준비합니다. 그런 다음 1차 항체를 섭씨 4도에서 밤새 16-18시간 동안 부드럽게 안와를 흔들면서 배양합니다.
플레이트를 세척하는 동안 5% NGS를 함유한 DPBS에서 항-마우스 680 및 항-토끼 800 항체를 희석하여 2차 배양 용액을 준비합니다. 다음으로, 최종 세척액을 흡인하고 250마이크로리터의 2차 배양 용액을 첨가합니다. 플레이트를 빛으로부터 보호하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 안와를 흔들면서 배양합니다.
그런 다음 700 나노 미터 및 800 나노 미터 형광 방출을 감지 할 수있는 이미징 시스템을 사용하여 플레이트를 스캔합니다. 시작점으로 초점 오프셋을 3으로 설정하고 감도를 MBP의 경우 1.5, 액틴의 경우 5.0, OLIG2의 경우 3.5로 설정합니다. 신호 과다 노출을 방지하기 위해 필요에 따라 감도 값을 조정하십시오.