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신경과학
0 조회수 • 5:37 분 • May 29th, 2025
얇은 감각 뉴런 말단인 표피내 신경 섬유 또는 IENF를 포함하는 표피 피부 조직 절편으로 시작합니다.
IENF는 미토콘드리아가 풍부하여 뉴런 신호 전달을 위한 에너지를 제공합니다.
조직에는 형광 표지된 IENF, 미토콘드리아 및 표피 핵이 있습니다.
도립 공초점 현미경을 사용하여 핵, IENF 및 미토콘드리아에 적합한 파장에서 개별 형광 신호를 순차적으로 획득합니다.
라이브 스캔을 활성화하여 표피층을 포함하는 IENF 신호를 캡처합니다.
그런 다음 각 신호에 대해 순차 스캔을 수행하여 형광 신호 누화를 제거합니다.
결합된 이미지에서 소프트웨어를 사용하여 청색 형광 표피 세포를 자르고 분리합니다.
그런 다음 자른 영역을 처리하여 녹색 IENF 신호와 빨간색 미토콘드리아 신호의 해상도를 향상시킵니다.
그런 다음 3D 표면 이미지를 생성하여 IENF용 마스크를 만든 다음 미토콘드리아 표면 이미지 위에 오버레이하여 신경 특이적 미토콘드리아를 분리합니다.
최종 출력에서 IENF는 청록색으로 나타나고 미토콘드리아는 작은 자홍색 구조로 나타납니다.
도립 레이저 스캐닝 공초점 현미경에서 40x 오일 침지 대물렌즈를 선택하십시오. 핵, 신경 섬유 및 미토콘드리아를 이미지화하기 위해 적절한 레이저와 검출기를 선택하십시오. 현미경 소프트웨어 12비트 강도 분해능에 다음 스캔 매개변수를 입력합니다. 2프레임 평균화로 600Hz의 스캔 속도, 2.2의 줌. 1024 x 1024의 스캔 해상도를 선택하여 최적화된 측면 해상도를 위해 현미경 소프트웨어를 설정합니다. z 스텝 크기가 210나노미터인 하나의 통풍 단위의 공초점 조리개를 선택하여 축 분해능 및 광학 절편화를 최적화합니다.
각 신호를 개별적으로 스캔하고 감지기 전압 및 오프셋을 조정하여 포화 및 과소 포화 픽셀을 제거합니다. 신경 신호에 대한 라이브 스캔을 활성화하고 z 초점 컨트롤을 조정하여 조직 절편 내의 신경 신호를 포함하는 현미경 소프트웨어에서 상부 및 하부 초점면을 찾아 설정합니다. 순차 스캐닝으로 최종 z 시리즈를 스캔하여 형광 신호 누화를 제거합니다.
원본 이미지의 복제 이미지에 선택 도구를 사용하여 표피 주위에 영역을 그려 각질층과 진피에서 표피를 분리합니다. 그런 다음 이미지를 선택 항목으로 자릅니다. 확산 함수 계산 기능을 사용하여 녹색 및 적색 형광 공초점 신호에 대한 점 확산 함수를 계산합니다. 그런 다음 오일의 중간 굴절률에 대한 매개변수를 1.515로 설정하고 40x 오일 대물렌즈의 개구수를 1.25로 설정합니다. 검출기 핀홀을 한 영역, 단위로 설정하고 레이저 여기 파장을 선택합니다.
100% 신뢰도로 설정된 반복 복원, 10사이클의 반복 한계, 녹색 및 빨간색 형광 신호의 디콘볼루션을 위해 녹색 및 빨간색 PSF를 사용합니다. 표면 생성 도구를 사용하여 체크되지 않은 스무스 피처, 임계값을 위한 절대 강도, 하한 임계값 3,000 및 상한 임계값 65,535를 선택하여 디콘볼루션된 신경 신호 주위에 서피스를 만듭니다. 표면을 10복셀 이상으로 유지합니다.
신경 표면의 편집 탭을 사용하여 단일 비신경 표면을 선택하거나 Control 키를 누른 상태에서 여러 개의 비신경 표면을 선택하여 비신경 표면을 제거합니다. Delete 버튼을 눌러 선택한 비신경 표면을 삭제합니다. 신경 표면에서 편집 탭을 사용하고 마스크 속성에서 모두 마스크 버튼을 누릅니다.
새 창에서 채널 선택 아래에서 채널 5 미토콘드리아 디컨볼루션을 선택한 다음 마스크를 적용하기 전에 중복 채널을 선택합니다. 내부 외부 상수 라디오 버튼을 누르고 복셀 외부 표면을 0.0으로 설정합니다. 그리고 OK 버튼을 누릅니다.
마지막으로, 표면 생성 도구를 사용하여 미토콘드리아 특정 표면을 생성하여 선택되지 않은 부드러운 기능을 선택하고 임계값에 배경 빼기를 사용하여 마스킹된 디콘볼루브 미토콘드리아 신호 주위에 표면을 만듭니다. 가장 큰 구의 지름을 1.50마이크로미터로, 하한 임계값을 2,000으로, 상한 임계값을 최대 65,535로 설정합니다. 표면을 1.0 복셀 이상으로 유지해야 합니다.