Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

0 조회수3:20 • May 29th, 2025

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형광 표지된 망막 신경절 세포(RGC)가 있는 형질전환 마우스로부터 분리된 망막 조직을 기록 챔버에 넣습니다.

시각 정보는 RGC로 전달되며, RGC의 축삭은 이를 시신경을 통해 뇌로 전달합니다.

RGC 아형은 수상돌기의 분지 패턴으로 구별되며, 이는 내부 망막층 내에서 하위 층으로 층화됩니다.

망막 조직을 평평하게 하고 조직 앵커를 사용하여 고정합니다.

챔버를 현미경 스테이지로 옮기고 RGC 생존력을 유지하기 위해 산소 용액을 관류합니다.

적외선 조명을 사용하여 형광 RGC를 식별합니다.

형광 추적자가 들어 있는 피펫을 RGC에 놓습니다.

막힘을 방지하기 위해 양압을 가합니다.

음압으로 전환하고 멤브레인을 피펫으로 끌어당겨 밀봉을 형성합니다.

흡입을 가하여 멤브레인을 파열시켜 수상돌기로의 추적자 확산을 촉진하는 전체 세포 구성을 설정합니다.

수지상 형태와 층화를 관찰하여 RGC 아형을 식별합니다.

산소가 함유된 세포외 용액으로 망막을 세척하고 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 유리 바닥 기록 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 집게를 사용하여 광수용체 층이 아래를 향하도록 조직을 조심스럽게 평평하게 만듭니다. 피펫을 사용하여 과도한 액체를 제거합니다. 그리고 나일론 메쉬가 있는 백금 링을 사용하여 조직을 고정합니다. 그런 다음 챔버를 산소가 함유된 세포외 용액으로 채우고 현미경 스테이지에 장착합니다. 분당 2-4밀리리터의 산소화된 세포외 용액으로 조직을 관류합니다.

이 절차를 준비하려면 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 전기생리학적 기록을 위해 유리 마이크로 피펫을 당깁니다. IR-DIC 광학을 사용하여 신경절 세포층을 관찰합니다. 그런 다음 약 480나노미터에서 epifluorescence를 사용하여 GFP와 신경절 세포를 식별합니다. 다음으로, DIC에서 세포내 용액으로 채워진 피펫을 찾습니다. 약간의 양압을 가하고 전압 오프셋을 0으로

합니다.

그런 다음 GFP 양성 셀에서 유리 마이크로 피펫을 내리고 테스트 전압 명령 단계를 적용하여 밀봉 저항을 모니터링합니다. 음압은 피펫과 세포막 사이에 기가옴 밀봉을 형성해야 합니다. 안정적인 밀봉을 형성한 후 전체 세포에 접근하기 위해 짧은 음압 펄스를 가하여 막을 파열시킵니다. 세포의 수상돌기가 형광 추적자로 채워질 때까지 1-2분 동안 기다리십시오.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026