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신경과학
0 조회수 • 3:54 분 • May 29th, 2025
형광 현미경 스테이지의 기록 챔버에 머리가 노출된 고정된 형질전환 초파리를 고정합니다.
파리의 버섯 몸체는 칼슘에 민감한 생물발광 융합 단백질을 발현하는 뉴런으로 구성되어 있으며, 이는 미리 로드된 보조 인자에 의해 활성화됩니다.
관류관을 챔버에 연결합니다. 꽃받침과 내엽에 초점을 맞춰 형광버섯 몸체를 찾습니다. 완충액으로 배액을 확인하십시오.
이미징 매개변수를 설정하고 꽃받침과 내엽에 초점을 맞춥니다. 어둠 속에서 각성제에 노출되기 전에 버섯 몸체의 기본 형광 이미지를 획득합니다.
칼슘 함유 완충액에 니코틴을 관류하여 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 활성화하여 칼슘 유입 및 생물발광 방출을 유발합니다.
버퍼로 세척하여 기본 상태를 복원합니다.
염화칼륨을 관류하여 뉴런을 탈분극시켜 세포내 칼슘 방출 및 생물 발광 신호 방출을 유발합니다.
완충액으로 세척하여 기본 조건을 복원합니다.
이미지를 분석하여 꽃받침과 내엽의 공간적 및 시간적 칼슘 활성을 평가합니다.
- 그런 다음 현미경 아래 마운트에 샘플을 놓고 배율을 5배로 조정합니다. 그런 다음 관류관을 천자를 통해 채널에 삽입합니다. 현미경을 형광 모드로 설정한 다음 중앙에 놓고 버섯 몸체에 초점을 맞춥니다. 버섯 몸체에 초점이 맞으면 배율을 20배로 변경합니다. 이미지 중앙을 다시 조정하고 초점을 조정합니다.
그런 다음 배수 장치를 배수 풀 위에 놓고 팁이 배수 풀 바로 위에 오도록 배수 션트의 높이를 조정합니다. 그런 다음 샘플을 링거 용액으로 30초 동안 세척하여 적절한 배액을 확인합니다. 마지막으로 실드를 아래로 당겨 외부 조명으로부터 장치를 차단합니다.
Photon Imager 프로그램의 자동화 시스템을 사용하여 초점을 미세 조정하고 버섯 몸체의 참조 형광 이미지를 촬영합니다. Control 키를 누른 상태에서 상자를 클릭하고 제자리로 드래그하여 꽃받침, 세포체 및 내측 엽 위의 관심 영역 상자의 위치를 조정합니다.
이제 약 5-10분 동안 기준선 값을 기록합니다. 그런 다음 스위치를 켜서 니코틴의 흐름을 시작합니다. 동시에 Enter 키를 누르고 니코틴의 흐름이 시작되었음을 나타내는 메모를 추가합니다. 1분 후에 플로우를 중지하고 플로우가 중지되었음을 나타내는 로그에 다른 메모를 작성하십시오. 그런 다음 링거 용액으로 샘플을 5분 동안 세척합니다.
샘플이 회복되는 동안 세척을 끄고 타이머를 추가로 5분 동안 설정한 다음 염화칼륨의 흐름을 시작할 준비를 합니다. 시작할 준비가 되면 염화칼륨의 흐름을 시작하고 샘플 로그에 100밀리몰 염화칼륨 시작을 입력합니다. 1분 후 흐름을 멈추고 염화칼륨을 샘플 로그에 차단합니다. 그런 다음 샘플을 링거 용액으로 1분 동안 세척하고 현미경을 형광 모드로 전환합니다. 최종 형광 이미지를 촬영한 다음 링거 용액을 끄고 샘플을 제거합니다.