Caenorhabditis elegans 뉴런에서 PolyQ 단백질 응집의 형광 수명 이미징

마취되고 연령이 일치하는 대조군 및 샤페론 결핍 Caenorhabditis elegans 벌레로 시작합니다.

두 그룹 모두 잘못 접히기 쉬운 뉴런에서 형광단 태그가 지정된 polyQ 단백질을 발현합니다.

대조군 벌레에서 샤페론 단백질은 잘못 접힌 polyQ 응집을 제한하는 반면, 샤페론 결핍 벌레에서는 잘못 접힌 polyQ가 쉽게 응집체를 형성합니다.

FLIM(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)을 위한 공초점 현미경 스테이지에 컨트롤 슬라이드를 놓습니다.

펄스 레이저를 사용하여 웜을 비춥니다.

레이저는 형광단을 여기시키고, 형광단은 바닥 상태로 돌아갈 때 광자를 방출합니다.

FLIM은 형광단이 여기된 상태로 유지되는 시간인 형광단 수명을 측정합니다.

샤페론 결핍 웜에서 polyQ 응집체는 형광단을 클러스터링하여 광자 방출 대신 인접한 형광단 간의 에너지 전달을 촉진하여 형광 수명을 단축합니다.

FLIM 소프트웨어는 이러한 수명을 처리하여 색상으로 구분된 맵을 생성하여 집계 시각화를 가능하게 합니다.

대조군에 비해 샤페론 결핍 웜의 형광 수명 감소는 polyQ 응집이 증가했음을 나타냅니다.

선충이 완전히 움직이지 않는지 확인하십시오. FLIM 수집 소프트웨어를 엽니다. Tab 버튼을 찾아 출력 활성화를 누릅니다. C. elegans가 장착된 슬라이드를 스테이지에 놓고 투과 모드에서 10배 배율 렌즈를 사용하여 슬라이드에서 선충류의 위치를 파악합니다. 슬라이드를 제거하고 대물렌즈를 63배 배율 렌즈로 전환한 다음 필요한 침지 매체를 적용합니다.

슬라이드를 무대에 놓고 선충의 위치를 파악합니다. 샘플 스캔을 시작합니다. 관심 영역을 선택하고 최대 투영 평면에 초점을 맞춥니다. FLIM 소프트웨어의 인터페이스에서 감지된 광자 수를 미리 봅니다. ADC 값은 네 번째에 1 곱하기 10, 1 곱하기 10 사이여야 합니다. 필요한 경우 초점을 다른 평면으로 이동하거나 레이저 출력을 높여 더 많은 광자를 수집합니다.

- 광자 쌓기를 피하되 충분한 양의 광자를 수집하여 수명 동안 잘 맞고 측정할 수 있도록 하십시오.

- 메뉴 모음에서 탭을 선택하여 획득 매개변수를 설정합니다. 스캔 동기화 인을 선택하여 단일 광자 감지를 허용합니다. 획득을 고정된 시간 또는 고정된 수의 광자로 설정합니다. 시작을 눌러 수집을 시작합니다. 소프트웨어를 열고 파일, FLIM 데이터 로드를 통해 FLIM 데이터 파일을 가져옵니다. 다른 세션과 다른 생물학적 반복에서 얻은 경우에도 하나의 조건에서 모든 샘플을 로드합니다.

필요한 경우 Segmentation, Segmentation Manager를 통해 많은 FLIM 사진에 대해 단일 선충을 분할합니다. 강조 표시될 때까지 관심 영역 주위로 자르기 도구를 드래그합니다. 완료되면 확인을 누릅니다. C. elegans의 강도 기반 이미지가 나타나는 작은 영역을 선택합니다. 해당 영역의 감쇠 곡선은 인터페이스 오른쪽에 있는 큰 감쇠 창에 나타납니다.

데이터 탭에서 수명을 추정하려면 40에서 300 사이의 임의의 통합 최소값을 설정하여 너무 어두워서 적합하지 않은 픽셀을 제외합니다. 시간 최소값과 시간 최대값을 선택하여 FLIM 신호를 이러한 값으로 제한합니다. 하나의 프리셋 카운트 광자를 변경하지 마십시오. 획득 중에 사용되는 레이저의 반복률을 메가헤르츠 단위로 입력합니다.

채도 픽셀을 제외하기 위해 게이트 최대값을 입력합니다. 수명 탭에서 사용할 전역 부속품을 선택합니다. 선택한 형광 감쇠가 다중 지수적이고 단일 이상의 수명을 나타내는 것으로 알려진 경우 지수 선택 수를 제외한 다른 매개변수를 변경하지 마십시오.

IRF 메뉴를 통해 IRF를 업로드합니다. IRF 이동을 추정하려면 IRF, 추정, IRF 이동을 선택합니다. 값 집합이 IRF 탭에 자동으로 나타납니다. 이 설정이 완료되면 이 탭의 다른 매개변수를 변경하지 마십시오. 모든 매개변수가 설정되면 데이터 세트 맞춤을 누릅니다. 파란색 선으로 강조 표시된 결과 맞춤은 모든 이벤트와 겹쳐야 합니다. 모든 사건이 적합을 따라 정렬될 때 좋은 적합을 얻을 수 있습니다.

소프트웨어 인터페이스의 오른쪽 상단 메뉴에 있는 매개변수 탭을 클릭하고 통계, 가중 평균을 선택하고 카이제곱 값이 가능한 한 1에 가까운지 확인합니다. 따라서 선택한 이미지의 수명 값은 타우 1로 표시됩니다. 파일, 강도 이미지 내보내기, 결과 테이블 맞춤, 이미지, 히스토그램을 통해 관심 있는 정보를 내보냅니다.