제브라피시 망막 재생 중 Muller Glial 핵 이동의 라이브 셀 이미징

질전환 제브라피쉬의 아가로스 포매 등쪽 망막 이식편으로 시작하여 배지와 함께 불소 디시에 장착합니다.

망막은 빛에 의해 유도된 광수용체 손상을 나타내며 GFP를 발현하는 핵이 있는 뮬러 신경교세포 또는 MGC를 포함합니다.

접시를 다광자 현미경 챔버에 넣습니다.

명시야 조명을 사용하여 망막에 초점을 맞춥니다.

형광 모드로 전환하여 MGC를 찾습니다.

신경절 세포 계층 또는 GCL에서 외부 핵 계층 또는 ONL로 z-스택을 구성합니다.

라이브 이미징을 시작합니다.

손상된 광수용체는 TNF-α를 방출하여 MGC를 활성화합니다.

MGC 핵은 DNA를 복제하기 위해 내부 핵층 또는 INL 내에서 기저로 이동합니다.

그런 다음 핵은 정점으로 ONL로 이동하여 유사분열을 거쳐 신경 전구세포를 생성합니다.

분열 후 MGC 핵과 전구세포는 기저적으로 INL로 다시 이동합니다.

전구세포는 증식하고 손상 부위로 이동하며 광수용체로 분화하여 망막 재생을 가능하게 합니다.

캡처된 이미지를 분석하여 핵 이동을 시각화합니다.

이미지 획득 소프트웨어에서 A1 MP GUI, TiPad, A1 Compact GUI 및 ND 획득 창을 엽니다. 다광자 이미징의 경우 A1 Compact GUI 창에서 IR NDD 옵션이 선택되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 설정 필드에서 첫 번째 이색성 미러에 대해 IR-DM을 선택하고 대역 통과 필터가 GFP 형광을 획득하기 위해 525에서 50으로 설정되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 A1 MP GUI 창에서 IR 레이저를 켭니다. 레이저가 준비되는 데 몇 분 정도 걸립니다. 그런 다음 파장을 910나노미터로 설정하여 GFP 형광을 여기시키고 자동 정렬 버튼을 클릭하여 레이저를 정렬합니다.

막 배양물을 다광자 현미경 스테이지에 놓은 후 광전자 증배관의 과다 노출을 방지하기 위해 셔터를 열기 전에 실내 및 장비 조명이 꺼져 있는지 확인하십시오. 소음 수준을 줄이려면 현미경을 어두운 환경에 보관하십시오.

영역 창에서 설정된 2의 확대/축소에서 300 x 300 픽셀의 시야각과 A1 Compact GUI 창에서 선택한 픽셀당 4.8마이크로초의 픽셀 체류 시간의 이미지를 획득합니다. A1 MP GUI 창의 획득 영역과 A1 Compact GUI 창의 게인을 변경하여 레이저 출력을 대략적으로 설정합니다.

이제 신경절 세포 레이어에 초점을 맞추고 ND 획득 창 내의 Z 하위 창에서 z-스택의 상단 초점면을 설정합니다. 내부 핵층의 대응 세포에 비해 둥글고 확대된 희미하게 표지된 GFAP 및 GFP 양성 세포의 존재를 특징으로 하는 외부 핵층의 수준을 통해 초점면을 이동합니다.

이 평면을 z-스택의 맨 아래로 설정합니다. 그런 다음 z 단계 크기를 0.7에서 1마이크로미터 사이로 설정합니다. z 강도 보정을 설정하려면 Z 강도 보정 창을 열고 ND에서 z-스택 범위를 설정합니다. 그런 다음 Z 강도 보정 창에서 하단 초점면을 클릭하고 레이저 강도와 게인을 설정합니다.

그런 다음 Z 강도 보정 창에서 z 값 옆에 있는 화살표를 클릭하여 선택한 초점면에 대한 Z 강도 보정 창의 장치 설정 아래에 표시되는 설정을 확인합니다. 중간 및 상단 평면에 대해 이 과정을 반복하여 레이저 출력과 이득을 높입니다.

A1 MP GUI 창에서 획득 영역을 설정하고 이미징 시작 시 15보다 큰 획득 영역과 126보다 높은 게인을 선택하여 광표백 및 노이즈 레벨 증가를 피하십시오. 그런 다음 Z 강도 보정 창에서 상대 강도 보정을 선택합니다. ND 획득 창의 시계열 하위 창에서 기간을 8시간으로 설정하고 간격을 지연 없음으로 설정합니다. 그런 다음 ND 획득 창의 Z-Stack 하위 창에서 Z 보정 실행을 클릭하여 3D 시계열을 수집합니다.