$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
배지가 포함된 멀티웰 플레이트에서 출생 후 쥐 새끼 뇌에서 얻은 소뇌 절편으로 시작합니다.
배지를 제거하고 슬라이스를 세포질 형광 염료 용액에 배양하여 과립 세포(GC)를 표지합니다.
슬라이스를 트랜스웰 인서트 멤브레인에 옮기고 여분의 염료를 제거합니다.
인서트를 제거하고 웰에 배지를 채웁니다. 그런 다음 인서트를 교체하고 조직을 덮을 용지를 추가합니다.
조직이 삽입 멤브레인에 부착될 수 있도록 배양합니다.
플레이트를 공초점 거시경에 부착된 인큐베이터로 옮기고 플레이트 위에 유리 덮개를 놓습니다.
배양 조건을 설정하고 조직을 추가로 배양한 다음 이미징을 시작합니다.
레이저 조명에 따라 표지된 GC는 형광을 발합니다.
타임랩스 이미지를 캡처하여 소뇌의 분자층을 통한 GC의 방사형 이동을 시각화합니다.
이미징 소프트웨어를 사용하여 GC의 이동 거리를 분석합니다.
검체를 슬라이스한 후 잘린 흰색 전구 피펫을 사용하여 일부 HBSS와 함께 6웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 최대 3개의 슬라이스를 로드합니다. 다음으로, 로딩된 각 웰에서 배지를 비운 후, 형광 염료 10마이크로몰을 포함하는 로딩 용액 5밀리리터를 추가합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하려면 플레이트를 호일로 덮으십시오. 그런 다음 35RPM으로 설정된 뮤테이터에 플레이트를 놓습니다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 배양하여 염료가 세포에 라벨을 붙이도록 합니다.
이제 이전과 같이 슬라이스를 3미크론 기공이 있는 트랜스웰 인서트의 멤브레인으로 옮깁니다. 그런 다음 로딩 매체를 흡인하고 슬라이스만 남깁니다. 이제 인서트와 슬라이스를 제거하여 1.9밀리리터의 DMEM으로 웰을 채웁니다. 그런 다음 인서트를 다시 넣고 100마이크로리터의 DMEM을 추가하여 조직을 덮습니다.
이 제제를 2시간 동안 배양한 후 과립 세포가 보입니다. 뚜껑이 없는 플레이트를 공초점 거시경에서 일정한 가스 흐름이 있는 환경 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 공초점 거시경의 플레이트 인서트에 유리 덮개를 놓습니다. 시간 경과 실험의 경우, 진행하기 전에 세포를 챔버에서 2시간 더 배양합니다.
조직 조각에서 이동하는 과립 세포를 시각화하려면 488나노미터 빛으로 제제를 비추고 2X 건식 대물렌즈를 사용합니다. 500에서 530나노미터까지의 형광 방출을 감지합니다. ImageJ를 사용하여 타임랩스 동영상의 각 이미지에 대해 표준 편차 모드를 사용하여 Z 스택 프로젝션을 수행합니다.
라벨이 붙은 과립 셀을 쉽게 볼 수 있도록 각 이미지의 대비와 밝기 수준을 조정합니다. 이제 파티클 분석 메뉴에서 수동 추적 플러그인을 선택합니다. 플러그인을 사용하여 타임랩스 이미지 시퀀스 전체에서 레이블이 지정된 각 셀 본체의 중심점을 클릭합니다. 그런 다음 추가 분석을 위해 원시 추적 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
각 셀 및 관련 위치를 식별하는 스마트 홈 도구를 사용하여 ImageJ에서 내보낸 원시 추적 데이터를 재구성합니다. 프로그램을 사용하여 각 셀의 총 이동 거리와 평균 이동 속도를 계산합니다.