0 조회수 • 3:06 분 • June 17th, 2025
입체 현미경 하에서 산소화된 생리학적 완충제가 포함된 장착 챔버에서 마취된 형질전환 제브라피쉬 유충으로 시작합니다.
뇌의 소뇌에는 형광 세포질 단백질을 발현하는 유전자 변형 푸르킨제 뉴런이 포함되어 있습니다.
여분의 배지를 제거한 다음 용융된 아가로스를 첨가하여 안정적인 이미징을 위해 유충을 고정시킵니다.
유충의 등쪽을 위로 향하여 소뇌를 시각화합니다.
응고되면 과도한 아가로스를 다듬습니다. 유리 바늘을 사용하여 뇌 위에 있는 색소 침착 피부를 절제하여 노출시킵니다.
도립 현미경으로 이미징하기 위해 아가로스 블록을 용융된 아가로스가 들어 있는 이미징 챔버로 뒤집습니다.
신경 기능을 보존하기 위해 생리학적 완충액을 첨가하십시오.
챔버를 도립 공초점 현미경 아래에 배치합니다. 여기광을 적용하여 형광 단백질을 여기시켜 표지된 뉴런을 시각화할 수 있습니다.
색소 침착된 피부 세포는 제거되지 않으면 여기광을 산란 및 흡수하여 형광 강도를 감소시킵니다.
피부 제거는 빛 투과를 개선하여 형광 강도를 향상시켜 뉴런 시각화를 촉진합니다.
유충을 매립하려면 파스퇴르 피펫을 사용하여 마취된 유충을 실체 현미경 아래의 장착 챔버로 옮깁니다. 유충이 여전히 움직일 수 있는 경우 물고기가 완전히 움직일 수 없게 될 때까지 물고기를 실험에 사용하지 마십시오. 유충이 움직이지 않으면 여분의 배지를 조심스럽게 제거하고 즉시 최소 1밀리리터의 저융점 아가로스를 유충에 첨가합니다.
등쪽 영역이 아가로스 표면에 최대한 가깝게 위를 향하도록 제브라피쉬의 방향을 잡습니다. 유충을 도립 현미경으로 이미지화할 경우 응고 후 유충을 포함하는 아가로스를 작은 직육면체 블록으로 자릅니다. 이미징을 위해 뇌를 노출시키려면 필요에 따라 관심 있는 뇌 영역에서 과도한 아가로스를 잘라내고 유리 바늘을 사용하여 조직에 너무 깊숙이 침투하지 않고 관심 영역 근처가 아닌 피부를 통해 작은 절개를 합니다.
피부 표면 바로 아래에서 바늘을 간신히 움직인 상태에서 관심 부위 위의 피부를 제거하거나 옆으로 밀어낼 수 있을 때까지 관심 부위 주위에 매우 작은 상처를 계속 조심스럽게 만듭니다. 모든 배아에서 조직이 제거되면 도립 현미경의 미리 준비된 이미징 챔버에 저융점 아가로스의 작은 방울을 추가하고 작은 주걱을 사용하여 직육면체 아가로스 블록을 이미징 챔버의 아가로스 방울 위로 180도 뒤집습니다. 아가로스가 응고되면 이미징 챔버를 신선한 ACSF로 채우고 유충 이미징을 시작합니다.