마우스 망막 외식에서 뉴런 수지상 역학의 타임랩스 컨포칼 이미징

JoVE Encyclopedia of Experiments

신경과학

0 조회수 • 3:15 분 • June 17th, 2025

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멤브레인 필터에 장착된 살아있는 출생 후 마우스 망막 외식편을 공초점 현미경 아래 배양 챔버에 배치하는 것으로 시작합니다.

망막은 스타버스트 무축핵 중간 뉴런의 막에서 형광 단백질을 발현하도록 형질감염됩니다.

미리 젖은 샘플 무게를 망막에 올려 안정화합니다.

챔버를 완충액으로 채웁니다.

뉴런 생존력을 보존하기 위해 챔버에서 최적의 완충액 흐름과 온도를 유지합니다.

침수 대물렌즈를 이미징 챔버에 배치합니다.

낙후형광 이미징을 시작합니다.

대물렌즈를 통해 향하는 레이저 광은 무축암 세포의 형광 단백질을 여기시킵니다.

방출된 형광은 동일한 대물렌즈를 통해 캡처되어 표지된 무축삭 세포를 시각화할 수 있습니다.

이미징을 위해 밝은 형광 세포를 식별합니다.

이미징 매개변수를 설정합니다.

여러 Z-평면에서 이미지를 캡처하여 전체 수지상 형태의 3D 시각화를 달성합니다.

시간 경과에 따른 수지상 형태의 변화를 추적하기 위해 타임랩스 이미징을 수행합니다.

라이브 이미징 배양 챔버를 조립하고 산소가 공급된 aCSF로 채웁니다. 펌프와 온도 컨트롤러를 켜고 온도가 섭씨 34도 이상으로 올라가지 않도록 합니다. 챔버 온도가 안정화되는 데 최대 한 시간이 걸릴 수 있습니다. 망막 절제술을 시작하기 전에 인큐베이션 챔버를 설정하는 것이 좋습니다. 안정적인 챔버 온도는 샘플 드리프트를 줄이는 데 도움이 됩니다.

망막 편평한 마운드를 관류실로 옮기려면 펌프를 멈추고 챔버에 있는 aCSF를 제거하십시오. 그런 다음 망막 플랫 마운트가 있는 MCE 디스크를 배양 챔버에 넣습니다. 샘플 분량을 미리 적셔 표면 장력을 깨뜨린 다음 평평한 마운드 위에 놓고 샘플 분량이 MCE 용지 위에 놓여 샘플 드리프트를 줄입니다. 예열된 aCSF로 챔버를 다시 채우고 분당 약 1밀리리터로 aCSF를 순환시킵니다.

25배 물 침지 대물렌즈가 있는 노즈 피스를 이미징 챔버에 배치합니다. epifluorescent light를 사용하여 관심 있는 표지된 세포를 스크리닝하고 이미징 볼륨을 조정하여 관심 있는 수지상 특징을 캡처합니다.

과포화 픽셀과 저포화 픽셀을 모두 식별하는 조회 테이블을 사용하여 픽셀이 과포화되지 않도록 레이저 출력을 조정합니다. 3D 이미징 볼륨을 획득하고 원하는 프레임 속도로 획득을 반복합니다. 이미징 볼륨은 샘플 드리프트를 보상하기 위해 각 시점 사이에서 조정할 수 있습니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026