핵 자기 공명 분광학을 사용하여 환경 Metabolomics를위한 낮은 밀도 Planktonic 커뮤니티에서 Metabolites의 농도

핵자기 공명 분광법은 환경 대사체학 연구에 있어 여러 가지 뚜렷한 장점을 제공하지만, 본 절차에서는 감도가 상대적으로 낮습니다. NMR 분석에 적합하도록 플라토닉 시스템에서 전체 군집 대사체를 농축 및 추출하기 위한 여과 방법이 보고되었습니다. 이는 먼저 추출 가능 성분을 제거하여 시료 수집용 필터를 특수하게 준비함으로써 이루어집니다.

절차의 두 번째 단계는 천연 또는 실험 샘플을 필터에 여과하는 것입니다. 세 번째 단계는 샘플 물질을 액체화하고 대사물을 추출하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 핵자기공명 분광법을 사용하여 샘플을 분석하고 적절하게 데이터를 통합하는 것입니다.

최종적으로, 대사체학 및 transams 접근법을 통해 환경 구배에 따른 천연 시료의 대사 변화나 실험적 조작에 대한 반응을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 원심분리와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 전체 커뮤니티를 샘플링할 수 있으며, 저밀도 시료의 경우 더 많은 양의 샘플 채취가 가능하다는 점입니다. 이 방법은 미생물 성장이 환경 변화에 어떻게 반응하는지와 같은 환경 금속 혼합물 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 절차의 시연은 제 연구실에서 진행될 예정입니다.

핀셋을 사용하여 깨끗한 500 milliliter Pyrex 비커에 필터를 넣는 것으로 이 프로토콜을 시작하십시오. 필터가 서로 달라붙는 것을 방지하기 위해 증류수를 부어 필터를 적신 후 잘 흔들어 예비 세척하십시오. 물을 따라 버리고 세척 과정을 두 번 더 반복하십시오.

마지막 세척 후, 비커에 Milli Q water 300 milliliters를 넣고 필터를 오토클레이브합니다. 필터의 오토클레이브가 완료되면, Milli Q water를 따라 버리고 이전과 동일하게 필터를 3회 세척하되, 이때는 Milli Q Water를 사용합니다.

핀셋을 사용하여 개별 필터를 알루미늄 호일과 같이 깨끗하고 건조한 표면에 놓은 뒤, 적절한 온도(예: 37°C)에서 건조시키거나 공기 중에서 건조합니다. 이제 필터는 본 프로토콜을 수행할 준비가 되었습니다. 무균 조작법을 사용하여, 유리 지지대가 포함된 25 mm 마이크로분석 필터 컬럼이 장착된 Millipore 스테인리스 스틸 3구 필터 매니폴드와 기계적 펌프를 사용합니다.

25 millimeter 필터 한 개를 필터 컬럼 베이스 위에 놓습니다. 컬럼을 장착하고 장치를 함께 고정합니다. 고영양 마이크로코즘(microcosm)에서 얻은 샘플 15 milliliters를 컬럼에 로딩합니다.

필터 매니폴드의 정지 밸브를 열고, 세포 파손을 최소화하기 위해 완만한 압력으로 펌프 필터를 가동합니다. 밀도가 낮은 시료의 경우, 물을 순차적으로 추가해야 할 수도 있습니다. 이때 물을 추가하는 간격 사이에 필터가 장시간 건조해지지 않도록 주의하십시오.

둘째, 해양 시료로부터 잔류 상자성 염을 제거하고 선택적으로 담수 세척을 수행할 수 있습니다. 여과가 완료되면 펌프를 끄고 밸브를 열어둔 상태로 유지하여 필터 하단에 여전히 음압이 가해지도록 합니다. 한 손으로 클램프와 필터 컬럼을 제거하십시오.

깨끗한 핀셋을 사용하여 필터를 잡습니다. 다른 한 손으로 필터를 접되, 완전히 접히지 않도록 주의하십시오. 멸균된 2 mL 마이크로 원심분리 튜브의 입구를 사용하여 필터를 눌러 고정합니다.

필터를 2 mL 튜브에 넣고 샘플 쪽이 안쪽을 향하도록 하여 펼쳐줍니다. 수용성 가용성 대사물을 추출하기 위해 즉시 액체 질소에서 급속 냉동합니다. 먼저 샘플을 하룻밤 또는 최소 10시간 동안 동결 건조한 후, 각 튜브에 스테인리스 스틸 크러셔(stainless steel crusher)를 추가합니다.

표준화된 인산칼륨 완충액 750 µL와 DSS 표준물질이 포함된 중수소 산화물을 첨가합니다. 필터에서 세포 물질을 제거하기 위해 워터 소니케이터를 사용하여 4°C에서 5분 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 깨끗한 핀셋으로 필터를 제거합니다.

밀 크러셔(mill crusher)를 사용하여 1600 RPM에서 5분 동안 세포를 파쇄합니다. 다음으로, 65 °C에서 배양합니다. 벤치탑 쉐이커(benchtop shaker)를 사용하여 15분 동안 흔들어 섞어줍니다.

배양 후, 깨끗한 핀셋을 사용하여 금속 크러셔를 제거합니다. 샘플을 13,000 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 취해 NMR 분광법 분석을 위해 NMR 튜브로 직접 옮깁니다.

여기에 샘플을 NMR 분광계에 로드하십시오. 샘플은 298 Kelvin에서 작동하며 3축 구배 TXI 프로브가 장착된 Bruker DRX 500 분광계로 분석합니다. 자석의 락(lock), 튜닝(tune) 및 심(shim) 조절을 수행하십시오.

TopSpin 인터페이스와 앞서 설명한 방법을 사용하여 1D proton NMR 스펙트럼을 얻거나, 필요에 따라 다른 분광기 인터페이스 소프트웨어를 활용하십시오. 본 실험에서는 1.2초의 반복 시간(repetition time)을 갖는 Watergate 펄스 시퀀스를 통해 잔류 수분 신호를 억제하여 스펙트럼을 획득하였습니다. 본 예시에서는 각 샘플당 128회의 트랜지언트(transients)를 수집하였습니다.

NMR 데이터 디렉토리를 NMR pipe 소프트웨어가 설치된 개인용 컴퓨터로 전송합니다. 로우 데이터를 처리하고, DSS 신호를 0 PPM 기준점으로 설정한 후, 스펙트럼의 위상을 수동으로 보정합니다. 전자상거래 웹사이트에서 제공하는 공개 FT two B 패키지를 사용하여 스펙트럼 데이터를 bin 단위로 디지털화합니다.

RNMR 또는 Atomics와 같은 다른 소프트웨어 유틸리티를 bin.Bin 작업에 사용할 수도 있습니다. 샘플 간의 비례적인 신호 변화를 나타내기 위해 데이터를 총 신호 또는 DSS 신호로 정규화할 수 있습니다. 이렇게 출력된 데이터는 이제 제시된 R과 같은 무료 소프트웨어 패키지를 이용한 주성분 분석(principle components analysis) 또는 PCA와 같은 후속 통계 분석에 사용할 수 있습니다.

시연된 절차를 통해 얻은 양성자 NMR 스펙트럼의 예시입니다. 이 스펙트럼들은 마이크로코즘 실험의 두 가지 시점에서 측정된 것이며, 조류의 대사 활동으로 인한 뚜렷한 차이를 보여줍니다. 4일 차 스펙트럼은 1일 차 샘플과 비교했을 때, 특히 3:00에서 4:00 PM 범위에서 피크가 상당히 많이 나타납니다.

이러한 피크들은 마이크로코즘 내에서 개화한 규조류에 의해 생성된 당류에 기인한 것일 수 있습니다. 유사한 실험에서, 처음 두 개의 주성분을 나타내는 Mr.Spectra의 bend에서 도출된 PCA score plot을 사용하여 인공 해수와 천연 해수 내 천연 플랑크톤 군집의 성장을 비교하였습니다. 이러한 통계적 접근 방식은 다차원 데이터를 더 단순한 형식(여기서는 2차원)으로 축소하여, 서로 인접한 기본 데이터 포인트들의 구조를 간단히 드러내 줍니다.

여기서는 각 축 또는 두 축 모두 더 유사하게 나타납니다. 두 처리군 간의 뚜렷한 대사 차이를 확인할 수 있습니다. 이 실험의 데이터는 멀티 오믹스 분석을 수행하는 데 사용되었습니다.

NMR을 18S 및 16S rRNA 유전자의 변성 구배 겔 전기영동(denaturing gradient gel electrophoresis) 기반 게놈 데이터와 결합하여 분석한 결과, 천연 해수와 인공 해수 마이크로코즘 사이에서 뚜렷한 미생물 군집 패턴이 나타났습니다. 천연 시스템에서 나타난 이러한 메타볼롬과 게놈 간의 상관관계는 이 접근 방식의 유용성을 입증합니다. 이 절차를 수행할 때는 오염을 최소화하기 위해 적절한 기술을 사용하는 것이 중요합니다.

마이크로바이옴이 특정 대사산물과 어떻게 상관관계를 갖는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 오믹스 수준의 생성 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.