Name: 핵 자기 공명 분광학을 사용하여 환경 Metabolomics를위한 낮은 밀도 Planktonic 커뮤니티에서 Metabolites의 농도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 배우세요 저밀도 플랑크톤 미생물 군집에서 핵자기공명분광법을 이용한 대사체 추출 및 농축 방법을. 여과, 동결건조, 수용성 대사체 추출 단계를 통해 환경 대사체학 연구에 활용할 수 있습니다.

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본 연구에 의해 부분적으로 지원되었다 보조금-원조 교육, 문화, 스포츠, 과학 기술부에서 답사의 연구 (JK) 및 학술 연구 (A) (JK 및 SM)에 도전을위한 과학 연구, 기술, 일본 . RIKEN FPR 교제 (경찰과)이 추가 지원을 제공했습니다. 저자는 Drs들에게 감사드립니다. Eisuke Chikayama, NMR 및 통계 분석과 기술 지원을 Yasuyo Sekiyama와 마미 오카모토.

1. Extractables를 제​​거하는 필터 준비 <ol><li> 25-mm 직경 0.22 μm의 기공 크기 Durapore PVDF 친수성 ​​필터 (Millipore)를 사용합니다. 깨끗한 500 ML Pyrex의 비커에 장소 필터 핀셋을 사용합니다. 증류수로 세 번 사전 린스. 당신은 서로 고집에서 필터를 방지하기 위해 린스로서 소용돌이. 300 ML 밀리 Q (Millipore) 또는 이에 상응하는 양질의 물을 추가합니다. 필터에서 extractables의 완전한 제거를 용이하게하기 위해 압력솥. </li><li> 밀리 Q를 붓고 다시 트리플 밀리 Q와 함께, 이번에는 필터를 린스. 깨끗하고 건조한 표면 (예 : 알루미늄 호일 같은)과 합당한 온도 (예, 37는 ° C) 또는 공기 건조시 건조 중의 족집게 장소 개별 필터를 사용합니다. 필터를 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. 샘플 재질의 여과 <ol><li> 유리가 지원과 함께 25 mm microanalysis 필터 컬럼으로이 프로토콜, Millipore 스테인리스 3 곳 필터 매니폴드를 입증할그리고 기계식 펌프가 사용됩니다. 무균 기술을 사용하여 필터를 열베이스에 단일 25-mm 필터를 추가, 컬럼을 적용하고 함께 클램프. </li><li> , 컬럼에 시료의 15 ML을 로드할 필터 매니폴드에 정지 밸브를 열고 펌프를 켜십시오. 세포 파손 (&lt;5 kPa)을 최소화하기 위해 부드러운 압력을 받고 필터링합니다. 그러한 손 또는 연동 펌프와 같은 다른 펌프는,이 프로토콜에 적용할 수 있습니다. 낮은 밀도의 샘플의 경우 물을 연속적으로 추가가 필요할 수 있습니다, 필터가 물을 첨가 사이의 오랜 기간 동안 건조한 놓지 않습니다. </li><li> 당신의 시료를 여과 후 해양 샘플 들어, 선택적 담수가 샘플과 필터에 잔류 상자 성체의 이온을 줄이기 위해 린스 수행할 수 있습니다. 이것은 분광계 자석보다 정확한 튜닝에 도움이 될 수 있습니다. 간단히 부드럽게 물을 작은 볼륨을 추가하고 마지막 부분에서 수집된 샘플을 통해 필터링합니다. </li><li> 일단 필터링이 완료되면 펌프를 끄고 밸브 ope를 떠나N 그래서 필터 부정적인 압력은 여전히​​있다. 클램프 및 필터 열을 제거합니다. </li><li> 한손으로, 필터의 보류를 데리고 깨끗한 핀셋을 사용합니다. 그 자체를 통해 필터를 접어하지만 포복 절도하지. 다른 손으로 필터를 누르고 멸균 2-ML microcentrifuge 튜브의 입술을 사용합니다. 필터의 양쪽 가장자리를 다시 놓치 않으이를 사용 후 족집게를 놓습니다. 접이식으로 45 ° 각도에서 Regrip. </li><li> 그것이 안쪽을 향하게 샘플 측면과 함께 열립니다 있도록 2-ML 관과 버전에 필터를 놓습니다. 당신은 멸균이 ML의 microcentrifuge 튜브 이렇게 둘이 필터를 넣을 수 있습니다. 이 필터를 사용하는 경우, 그들은 가능​​한 한 조금은 중복 보장합니다. 즉시 (최소 -30 ° C)에 고정. </li></ol> 3. 수성 - 수용성 Metabolites의 추출 <ol><li> 샘플의 하룻밤 혹은 적어도 10 시간을 Lyophilize. </li><li> lyophilization 후, 각 튜브 (Tokken)에 스테인레스 스틸 분쇄기를 추가합니다. 750 μl 표준화된 칼륨 추가2,2 - 디메틸 -2 - silapentane-5-산염 (DSS) 표준 (KPI와 중수소 산화 (2 H&gt; 90 %)의 인산염 NMR 버퍼, 38.3 MM KH 2 PO 4, 61.7 MM K 2 HPO 4, DSS 0.1 MM, 산도 7.0, 90 % D 2 O) 2. </li><li> 물 sonicator에서 ° C (Bioruptor, Diagenode)이 필터에서 세포 물질을 제거하려면 4에서 5 분 샘플을 Sonicate. 깨끗한 핀셋으로 필터를 제거합니다. </li><li> 5 분 밀 분쇄기 (1600 RPM)를 사용하여 세포를 중단. </li><li> 15 분 동안 벤치 위로 흔드는 (Eppendorf)에 (1,400 RPM) 흔들림으로 65 ° C에서 품어. </li><li> 깨끗한 핀셋으로 금속 돼지를 제거하고 5 분 13,000그램에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> NMR 분광법을위한 NMR 튜브에 직접 뜨는을 분산. </li></ol> 4. NMR 분광학 및 데이터 분석 <ol><li> (여기서, Bruker DRX-500 분광계가 장착된 NMR 분광계로 샘플을로드XWIN-NMR을 실행하는 컴퓨터)에 의해 제어 트리플 축 기울기와 TXI 프로브. </li><li> XWIN-NMR 인터페이스에서 적절한 이전에 다음 ID로 출판 방법에게 2,15를 사용하여 1D 1 H NMR의 스펙트럼을 구합니다. 현재 연구 1 H NMR 스펙트럼은 1.2 s의 반복 시간과 함께 워터 게이트 펄스 시퀀스에 의해 억압 받고 있었다 298 K. 잔여 물이 신호에서 500.03 MHz로 DRX-500 분광계 운영에 기록되었다. 128 과도는 스펙트럼 당 32,000 데이터 포인트를 얻기 위해 수집되었다. </li><li> NMRPipe 소프트웨어 16 설치된 PC에 NMR 데이터 디렉토리를 전송합니다. 0 PPM 참조 그런 다음 수동으로 스펙트럼을 단계적으로 폐지로 원시 데이터와 설정 DSS를 처리합니다. 디지털화 통합 또는 'binning'그들을 같은 rNMR, Automics와 같은 소프트웨어와 함께, 또는 ECOMICS 웹 사이트 (에서 공개 FT2B 패키지를 사용하여 개별 값의 집합으로 스펙트럼 데이터 <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> ) 3,17. 일 년, 스펙트럼은 0.032 PPM 통합 ECOMICS를 사용하는 지역 및 DSS 또는 전체 신호 강도 중 하나에 대한 표준을 통해 0.5 및 10.5 PPM 사이에 예를 들어 통합되었다 있습니다. 출력 데이터는 이제 이러한 연구 18 같은 무료 소프트웨어 패키지를 사용하는 주요 구성 요소 분석 (PCA)와 같은 다운 스트림 통계 분석을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 1 H NMR의 스펙트럼의 예제는 위의 방법은 그림 1에 표시된 사용하여 획득하였습니다. 이러한 샘플은 소우주 실험의 두 시간이 지점에서 algal 신진 대사 활동으로 인해 명확한 차이점을 보여줍니다. 4 일 스펙트럼은 1 일 샘플에 비해 특히 3-4 PPM 범위에서 피크의 상당한 풍요로움을 보여줍니다. 이 봉우리는 소우주 내에서 규조류는을 피는 제작한 설탕에 의한 것이 있습니다. 인공 또는 자연 해수의 천연 플랑크톤 커뮤니티의 성장을 비교 유사한 실험에서 통계적 접근 방식의로딩 플롯은 스펙트럼 내에서 봉우리를 식별할 수있는 반면 binned NMR의 스펙트럼에서 파생된 주요 구성 요소 분석 (PCA) 점수 줄거리 등 uch는 두 개의 트리 트먼트 (그림 2) 사이의 명확한 대사의 차이를 표시하는 데 사용할 수있는 형상 데이터의 분포 . 이러한 결과는 같은 게놈 지문 채취 기법에서 같은 다른 omics 수준, (그림 3)에서 데이터와 비교할 수 있습니다. ; 이러한 NMR의 피크는 (BMRB에서 예 개별적으로 질의를 할수 <a href="http://www.bmrb.wisc.edu/">http://www.bmrb.wisc.edu/</a> 19 일, 또는 전체 스펙트럼은 (시 SpinAssign있는 등 통계적으로 분석할 수) <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken. JP /? 조치 = nmr_search</a> ) 2. 이 예제에서는 트리 트먼트의 차이점은 천연 플랑크톤 커뮤니티 metabolites의 스펙트럼의 설탕 지역의 봉우리 풍부한 (3.39 PPM으로 4.04 PPM)에 의한 것이라하고, 인공 해수 사회에 특징적인 여러 봉우리가 미정 IDE 있었다락테이트 및 SpinAssign를 사용하여 편대로 ntified. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1.이 절차를 사용하여 처리 표본에서 얻은 대표 1 H NMR의 스펙트럼. 소우주 샘플은 이전에 (매일 1) 및 (4 일) 강렬한 diatom의 개화 중에 찍은 사진. NMR 실험은 내부 표준 피크의 높이 (; 0 PPM DSS)으로 정규화 신호로 Bruker DRX-500에서 수행되었다. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 자연과 함께 microcosms 재배 자연스럽게 - 파생 미생물의 planktonic 커뮤니티 (오픈 다이아몬드) 또는 인공 (블랙 서클) 해수의 metabolomes에서 binned NMR의 스펙트럼을위한 주요 구성 요소 분석 (PCA) 점수 플롯. 클리어 신진 대사의 차이는 scatterplot에서 볼 수 있습니다. 이러한 분석에서 로딩 음모 그 다음에 중요성을 별개의 봉우리를 식별하는 데 사용될 수시스템은, 필요에 따라 이들 봉우리들은 더 이상 분석할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 멀티 omics 분석의 예제는 게놈 데이터와 NMR을 결합. 커뮤니티 조성은 denaturing 기울기 겔 18S의 전기 영동 (왼쪽)와 그림 2에서 분석하는 것과 같은 샘플에서 16 (오른쪽) rRNA의 유전자를 기반으로 또한 자연 (오픈 다이아몬드)과 인공 (검은색 원) 해수 microcosms 사이에 별개의 미생물 커뮤니티의 패턴을 보여줍니다. 자연 시스템의 metabolome과 게놈 사이의 이러한 대응은이 접근법의 유용성을 보여줍니다.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기서 보여준 여과 및 신진 대사 추출 방법은 NMR의 metabolomics에 충분한 금액을 회수하기 위해 미생물 planktonic의 바이오 매스를 얻을 수 있습니다. KPI 및 1D 1 H NMR을 사용하여 수성 - 용해 metabolites만을 추출을 시연하는 동안 다른 추출 용매와 spectroscopic 방법을 사용할 수 있습니다. 하나의 유용한 예제는 이기종 샘플에서 우수한 NMR의 스펙트럼을 생산하기 위해 그림과 상자 성체의 이온에 의한 오염에 덜 민감로서 해양 시료 15 발견되었습니다 세미 극지 용매와 같은 진정제를 맞았을 메탄올의 사용이다. 이런 경우에는 위의 추출의 펠렛은 연속 extractions 보관하여야한다. 우리의 이전 작업은 배양 시간 및 온도와 NMR 분광법 15-20에 대한 직접적인 수성 추출의 적합성 아래 스펙트럼의 안정성을 보이지 않고있다. 그러나 연구자는 또한 dena를 사용하여 예를 들어, 추출 단계를 수정하는 것이 좋습니다이전 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 0.22 μm의 친수성 ​​PVDF Durapore 필터, 25mm </td><td> Millipore </td><td> GVWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Microanalysis 필터 홀더, 25mm가 유리를 지원 fritted </td><td> Millipore </td><td> XX1002500 </td><td></td></tr><tr><td> 3 - 장소 매니폴드, 47mm, 스테인레스 스틸 </td><td> Millipore </td><td> XX2504735 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 와코 </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> 와코 </td><td> 164-04295 </td><td></td></tr><tr><td> 중수소 산화, 2 H&gt; 90% </td><td> Campridge 동위 원소 Laboratoties </td><td> DLM-4 </td><td></td<html> &gt; </tr><tr><td> DSS </td><td> Fluka </td><td> 92,754 </td><td></td></tr><tr><td> Automill </td><td> Tokken </td><td> TK-AM4 </td><td> 스테인레스 스틸 crushers 포함 </td></tr><tr><td> Thermomixer 편안함 </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 000.011 </td><td></td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 </td><td></td></tr><tr><td> 진공 증발기 </td><td> EYELA </td><td> CVE-3100 </td><td></td></tr><tr><td> NMR </td><td> Bruker </td><td> 5mm-TXI 프로브와 DRX-500 </td><td></td></tr><tr><td> 스펙트럼 binning 도구 </td><td> 원래 개발 </td><td> FT2DB </td><td> <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> </td></tr><tr><td> 신진 대사 주석 도구 및 데이터베이스 </td><td> 원래 개발 </td><td> SpinAssign </td><td>= nmr_search &quot;&gt; http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search </td></tr></tbody></table>

핵 자기 공명 분광학을 사용하여 환경 metabolomics를위한 낮은 밀도 planktonic 커뮤니티에서 metabolites의 농도

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

환경 metabolomics는 유기체가 반응 및 생화 학적 수준 1의 환경과 서로 상호 작용하는 방법에 새로운 이해를 추진하고 신흥 분야이다. 핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 공부에 대한 상당한 약속과 함께, 가스 크로마 토그래피 - 질량 분석계 (GC-MS) 등 여러 기술 중 하나입니다. NMR의 장점은, 타겟이 분명하지 않은 분석에 적합한 구조 정보를 제공하며 스펙트럼은 각각의 신진 대사 스펙트럼 2,3 최근에 사용 가능한 데이터베이스에 대한 양적 및 통계 매너에 쿼리할 수 있습니다. 또한, NMR 분광 데이터는 서로 taxa의 생리적 반응과 환경 4,5,6의보다 포괄적인 이해를 제공하기 위해 다른 omics 수준 (예 : transcriptomics, 유전체학)의 데이터와 조합하여 사용할 수 있습니다. 그러나 NMR은 어려운에게주고, 다른 metabolomic 기법 미만 구분 AP샘플 인구가 낮은 잘 정의와 같은 전체 조직, biofluids 또는 셀 - 문화 등 쉽게 추출물 소스.에서 metabolites에 비해 낮은 밀도와 신진 대사 농도가 될 수있는 천연 미생물 시스템에 플라이 따라서 날짜에 수행된 미생물의 몇 가지 직접적인 환경 metabolomic 연구는 이러한 호스트 symbiont 시스템과 같은 문화 기반 또는 쉽게 정의 고밀도 생태계, 안정 동위 원소 라벨이 될 수 직감 환경의 공동 문화 또는 조작 구축으로 제한되었습니다 또한 NMR 신호에게 7,8,9,10,11,12을 향상시키기 위해 사용됩니다. NMR에 적합한 농도로 환경 metabolites의 농도와 컬렉션을 촉진 방법은 부족합니다. 최근 관심이 많은 에너지와 물질의 흐름은 planktonic 커뮤니티 13,14에 의해 매개되는 수생 환경 내에서 생물의 환경 metabolomics 부여 되었기 때문에, 우리는 집중하는 방법을 개발했습니다기 및 여과에 의한 planktonic의 미생물 시스템과 전체 - 커뮤니티 metabolites의 추출. 상용 친수성 ​​폴리-1 ,1-difluoroethene (PVDF) 필터는 특별히 완전히 달리 후속 분석에서 오염 물질이 나타날 수 extractables를 제​​거하는 처리됩니다. 이러한 처리 필터는 다음 관심있는 환경 또는 실험용 샘플을 필터링하는 데 사용됩니다. 젖은 샘플 자료가있는 필터는 동결 건조된이며 수성 - 용해 metabolites는 표준화된 칼륨 인산 추출 버퍼 2를 사용하여 기존의 NMR 분광법에 대해 직접적으로 압축이 풀립니다. 이러한 방법에서 파생된 데이터는 통계적으로 의미있는 패턴을 식별하는 분석, 또는 지역 사회와 생태계 기능의 포괄적인 이해를위한 다른 omics 수준과 통합 할 수 있습니다.

미생물 planktonic 커뮤니티에서 신진 대사 추출을위한 방법을 설명하고있다. 전체 지역 사회의 샘플링 특별히 준비 필터로 여과에 의해 이루어진다. lyophilization 후 수성 - 용해 metabolites가 추출됩니다. 이 접근법은 자연이나 실험적인 미생물 커뮤니티의 횡단 omics 조사에 환경 metabolomics의 적용을 허용합니다.

핵 자기 공명 분광학을 사용하여 환경 Metabolomics를위한 낮은 밀도 Planktonic 커뮤니티에서 Metabolites의 농도

환경 대사체학은 생물체가 환경에 어떻게 반응하고 상호작용하는지에 대한 새로운 이해를 촉진하는 신흥 분야이며, 각...

핵자기 공명 분광법은 환경 대사체학 연구에 있어 여러 가지 뚜렷한 장점을 제공하지만, 본 절차에서는 감도가 상대적으로 낮습니다. NMR 분석에 적합하도록 플라토닉 시스템에서 전체 군집 대사체를 농축 및 추출하기 위한 여과 방법이 보고되었습니다. 이는 먼저 추출 가능 성분을 제거하여 시료 수집용 필터를 특수하게 준비함으로써 이루어집니다.절차의 두 번째 단계는 천연 또는 실험 샘플을 필터에 여과하는 것입니다. 세 번째 단계는 샘플 물질을 액체화하고 대사물을 추출하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 핵자기공명 분광법을 사용하여 샘플을 분석하고 적절하게 데이터를 통합하는 것입니다.최종적으로, 대사체학 및 transams 접근법을 통해 환경 구배에 따른 천연 시료의 대사 변화나 실험적 조작에 대한 반응을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 원심분리와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 전체 커뮤니티를 샘플링할 수 있으며, 저밀도 시료의 경우 더 많은 양의 샘플 채취가 가능하다는 점입니다. 이 방법은 미생물 성장이 환경 변화에 어떻게 반응하는지와 같은 환경 금속 혼합물 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 절차의 시연은 제 연구실에서 진행될 예정입니다.핀셋을 사용하여 깨끗한 500 milliliter Pyrex 비커에 필터를 넣는 것으로 이 프로토콜을 시작하십시오. 필터가 서로 달라붙는 것을 방지하기 위해 증류수를 부어 필터를 적신 후 잘 흔들어 예비 세척하십시오. 물을 따라 버리고 세척 과정을 두 번 더 반복하십시오.마지막 세척 후, 비커에 Milli Q water 300 milliliters를 넣고 필터를 오토클레이브합니다. 필터의 오토클레이브가 완료되면, Milli Q water를 따라 버리고 이전과 동일하게 필터를 3회 세척하되, 이때는 Milli Q Water를 사용합니다.핀셋을 사용하여 개별 필터를 알루미늄 호일과 같이 깨끗하고 건조한 표면에 놓은 뒤, 적절한 온도(예: 37°C)에서 건조시키거나 공기 중에서 건조합니다. 이제 필터는 본 프로토콜을 수행할 준비가 되었습니다. 무균 조작법을 사용하여, 유리 지지대가 포함된 25 mm 마이크로분석 필터 컬럼이 장착된 Millipore 스테인리스 스틸 3구 필터 매니폴드와 기계적 펌프를 사용합니다.25 millimeter 필터 한 개를 필터 컬럼 베이스 위에 놓습니다. 컬럼을 장착하고 장치를 함께 고정합니다. 고영양 마이크로코즘(microcosm)에서 얻은 샘플 15 milliliters를 컬럼에 로딩합니다.필터 매니폴드의 정지 밸브를 열고, 세포 파손을 최소화하기 위해 완만한 압력으로 펌프 필터를 가동합니다. 밀도가 낮은 시료의 경우, 물을 순차적으로 추가해야 할 수도 있습니다. 이때 물을 추가하는 간격 사이에 필터가 장시간 건조해지지 않도록 주의하십시오.둘째, 해양 시료로부터 잔류 상자성 염을 제거하고 선택적으로 담수 세척을 수행할 수 있습니다. 여과가 완료되면 펌프를 끄고 밸브를 열어둔 상태로 유지하여 필터 하단에 여전히 음압이 가해지도록 합니다. 한 손으로 클램프와 필터 컬럼을 제거하십시오.깨끗한 핀셋을 사용하여 필터를 잡습니다. 다른 한 손으로 필터를 접되, 완전히 접히지 않도록 주의하십시오. 멸균된 2 mL 마이크로 원심분리 튜브의 입구를 사용하여 필터를 눌러 고정합니다.필터를 2 mL 튜브에 넣고 샘플 쪽이 안쪽을 향하도록 하여 펼쳐줍니다. 수용성 가용성 대사물을 추출하기 위해 즉시 액체 질소에서 급속 냉동합니다. 먼저 샘플을 하룻밤 또는 최소 10시간 동안 동결 건조한 후, 각 튜브에 스테인리스 스틸 크러셔(stainless steel crusher)를 추가합니다.표준화된 인산칼륨 완충액 750 µL와 DSS 표준물질이 포함된 중수소 산화물을 첨가합니다. 필터에서 세포 물질을 제거하기 위해 워터 소니케이터를 사용하여 4°C에서 5분 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 깨끗한 핀셋으로 필터를 제거합니다.밀 크러셔(mill crusher)를 사용하여 1600 RPM에서 5분 동안 세포를 파쇄합니다. 다음으로, 65 °C에서 배양합니다. 벤치탑 쉐이커(benchtop shaker)를 사용하여 15분 동안 흔들어 섞어줍니다.배양 후, 깨끗한 핀셋을 사용하여 금속 크러셔를 제거합니다. 샘플을 13,000 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 취해 NMR 분광법 분석을 위해 NMR 튜브로 직접 옮깁니다.여기에 샘플을 NMR 분광계에 로드하십시오. 샘플은 298 Kelvin에서 작동하며 3축 구배 TXI 프로브가 장착된 Bruker DRX 500 분광계로 분석합니다. 자석의 락(lock), 튜닝(tune) 및 심(shim) 조절을 수행하십시오.TopSpin 인터페이스와 앞서 설명한 방법을 사용하여 1D proton NMR 스펙트럼을 얻거나, 필요에 따라 다른 분광기 인터페이스 소프트웨어를 활용하십시오. 본 실험에서는 1.2초의 반복 시간(repetition time)을 갖는 Watergate 펄스 시퀀스를 통해 잔류 수분 신호를 억제하여 스펙트럼을 획득하였습니다. 본 예시에서는 각 샘플당 128회의 트랜지언트(transients)를 수집하였습니다.NMR 데이터 디렉토리를 NMR pipe 소프트웨어가 설치된 개인용 컴퓨터로 전송합니다. 로우 데이터를 처리하고, DSS 신호를 0 PPM 기준점으로 설정한 후, 스펙트럼의 위상을 수동으로 보정합니다. 전자상거래 웹사이트에서 제공하는 공개 FT two B 패키지를 사용하여 스펙트럼 데이터를 bin 단위로 디지털화합니다.RNMR 또는 Atomics와 같은 다른 소프트웨어 유틸리티를 bin.Bin 작업에 사용할 수도 있습니다. 샘플 간의 비례적인 신호 변화를 나타내기 위해 데이터를 총 신호 또는 DSS 신호로 정규화할 수 있습니다. 이렇게 출력된 데이터는 이제 제시된 R과 같은 무료 소프트웨어 패키지를 이용한 주성분 분석(principle components analysis) 또는 PCA와 같은 후속 통계 분석에 사용할 수 있습니다.시연된 절차를 통해 얻은 양성자 NMR 스펙트럼의 예시입니다. 이 스펙트럼들은 마이크로코즘 실험의 두 가지 시점에서 측정된 것이며, 조류의 대사 활동으로 인한 뚜렷한 차이를 보여줍니다. 4일 차 스펙트럼은 1일 차 샘플과 비교했을 때, 특히 3:00에서 4:00 PM 범위에서 피크가 상당히 많이 나타납니다.이러한 피크들은 마이크로코즘 내에서 개화한 규조류에 의해 생성된 당류에 기인한 것일 수 있습니다. 유사한 실험에서, 처음 두 개의 주성분을 나타내는 Mr.Spectra의 bend에서 도출된 PCA score plot을 사용하여 인공 해수와 천연 해수 내 천연 플랑크톤 군집의 성장을 비교하였습니다. 이러한 통계적 접근 방식은 다차원 데이터를 더 단순한 형식(여기서는 2차원)으로 축소하여, 서로 인접한 기본 데이터 포인트들의 구조를 간단히 드러내 줍니다.여기서는 각 축 또는 두 축 모두 더 유사하게 나타납니다. 두 처리군 간의 뚜렷한 대사 차이를 확인할 수 있습니다. 이 실험의 데이터는 멀티 오믹스 분석을 수행하는 데 사용되었습니다.NMR을 18S 및 16S rRNA 유전자의 변성 구배 겔 전기영동(denaturing gradient gel electrophoresis) 기반 게놈 데이터와 결합하여 분석한 결과, 천연 해수와 인공 해수 마이크로코즘 사이에서 뚜렷한 미생물 군집 패턴이 나타났습니다. 천연 시스템에서 나타난 이러한 메타볼롬과 게놈 간의 상관관계는 이 접근 방식의 유용성을 입증합니다. 이 절차를 수행할 때는 오염을 최소화하기 위해 적절한 기술을 사용하는 것이 중요합니다.마이크로바이옴이 특정 대사산물과 어떻게 상관관계를 갖는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 오믹스 수준의 생성 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

진보 식민 절차는 더욱 호스트 간장 대사에 미치는 영향을 평가하기 위해 설명되어 있습니다. 간장 신진 대사가 고해상도 매직 앵글 스피닝 (HR의 MAS) 그대로 생검의 NMR 프로 파일링에 의해 평가하는 동안 식민지는 NMR 기반의 신진 대사 프로 파일링 공동 metabolites 미생물의 비뇨기 배설을 평가하여 invasively 아닌 모니터입니다.

하여 세균없는 마우스 프로 그레시브 콜로니 동안 간장 신진 대사 변경 사항 평가 1 H NMR 분광학

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

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여기서, 고해상도 1 H, 13 C 핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 캡슐화 어유 보충제의 정성 및 정량 분석을위한 신속하고 신뢰할 수있는 도구로서 사용되었다.

생선 기름 보충제의 지질 프로필의 신속한 평가를위한 강력한 도구로 NMR 분광학

이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

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Pure Shift 핵 자기 공명: 식물 대사체학을 위한 새로운 도구

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이 프로토콜은 맞춤형 생물반응기 시스템을 과분극 ¹³C NMR 분광법과 통합하여 살아있는 세포의 실시간 피루브산 대사를 측정함으로써 대사 연구 및 약물 스크리닝 응용 분야의 재현성과 운동 정확도를 개선합니다.

과분극 13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

이 프로토콜은 휘발성 염 용액 세척, 급속 액체 질소 담금질, 동결 건조 및 -8°C 저장을 결합하여 단일 세포 질량 분석법(SCMS)을 위한 세포 대사 산물을 보존하는 것을 목표로 합니다. 이는 액체 질소 담금질이 대사 산물 프로필을 유지하는 데 필수적이며, 대사 변화를 방지하기 위해 장기간 냉장 보관을 최소화해야 함을 보여줍니다.

단일 세포 질량 분석법 대사체학 연구를 위한 시료 전처리: 결합된 세포 세척, 담금질, 건조 및 보관

배우세요 저밀도 플랑크톤 미생물 군집에서 핵자기공명분광법을 이용한 대사체 추출 및 농축 방법을. 여과, 동결건조, 수용성 대사체 추출 단계를 통해 환경 대사체학 연구에 활용할 수 있습니다.

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