유전자 발현을 평가하기 위한 마우스 척수에서 연막하 유전자 전달

마취된 쥐를 가져다가 등을 면도하고 피부를 소독하십시오.

피부를 절개하고 척추뼈에서 근육을 분리한 다음 클램프를 사용하여 집어넣습니다.

척추판에 구멍을 뚫어 균열을 만든 다음 뼈 조각을 제거하여 외부 척수막인 경막을 노출시킵니다.

바늘을 사용하여 경막 개구부를 만들고 밑에 있는 연막에 구멍을 뚫어 척추 조직에 직접 접근할 수 있도록 연막하 공간으로 들어갑니다.

형광 단백질 발현 유전자를 운반하는 재조합 아데노 관련 바이러스의 현탁액이 들어 있는 전달 바늘을 가져와 현탁액을 주입합니다.

바늘을 빼고 근육과 피부를 봉합한 다음 마우스가 회복되도록 합니다.

바이러스는 뉴런과 신경교세포의 수용체에 결합하여 엔도사이토시스를 얻습니다.

핵 내부로 들어가면 바이러스는 유전자 발현을 유발하여 형광 단백질을 생성합니다.

연막하 유전자 전달 모델은 이제 척수에서 표적 유전자 발현을 평가할 준비가 되었습니다.

수술을 위해 동물을 적절하게 마취하는 것부터 시작하십시오. 여기서는 이소플루란이 사용됩니다. 계속하기 전에 발 꼬집기 반응이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 안과 연고로 눈을 덮으십시오. 다음으로 가발기로 동물의 등을 면도하고 2% 클로르헥시딘으로 피부를 깨끗이 닦습니다.

요추 연막하 주사를 시행하는 경우 메스로 T8에서 L1 척추 위에 있는 피부를 절단합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 T10에서 T12 척추로 척추주위 근육을 분리합니다. 마우스 척추 클램프를 사용하여 동물을 표준 정위 프레임에 장착합니다. 다음으로, 치과용 드릴을 사용하여 균열이 나타날 때까지 T10에서 T12 척추의 박판 양쪽을 면도합니다.

그런 다음 겸자를 사용하여 금이 간 뼈 조각을 제거하고 요추 척수의 등쪽 표면을 노출시킵니다. 이제 경막이 보입니다. 30게이지 스테인리스 스틸 바늘을 사용하여 경막에 1-2mm 절개를 합니다.

밑에 있는 연막이 손상되지 않도록 경막을 조심스럽게 잘라내는 것이 중요합니다.

이제 집게로 절단된 경막의 가장자리를 잡고 경막 구멍을 최대 5mm까지 확장합니다. 유리 모세관 홀더를 사용하여 34 게이지 피아 관통 바늘과 36 게이지 주입 바늘을 두 개의 개별 XYZ 매니퓰레이터의 Z 암에 장착합니다.

그런 다음 PE-10 또는 PE-20 튜브와 연결된 50마이크로리터 마이크로 주사기를 사용하여 AAV9-UBI-GFP 바이러스를 로드합니다. 바이러스가 로드된 후 튜브 끝을 주사 바늘에 연결합니다. 다음으로, 8배에서 10배 배율로 설정된 수술용 해부 내시경을 통해 보면서 X 암을 사용하여 연질 관통 바늘을 1mm 깊이까지 내립니다. 관통 바늘의 각도를 조직 표면에 대해 5도에서 10도로 유지하십시오.

연막을 연 후 X 암을 사용하여 연막하 공간에서 연막 관통 바늘을 제거합니다. 혈관과 같은 랜드마크를 사용하여 관통된 부위를 기록하십시오. 두 번째 매니퓰레이터의 X, Y 및 Z 암을 움직여 AAV9 바이러스 탑재 주사 바늘의 끝을 연막 관통 부위에 배치합니다.

그런 다음 주사 바늘 끝을 연막하 공간에 약 0.5mm 삽입한 후 Z 암을 사용하여 연막을 약 0.3mm 들어 올린 다음 X 암을 사용하여 바늘을 연막하 공간으로 수평으로 계속 전진시킵니다. 바늘이 약 2-3mm 깊이의 연막하 공간에 들어갈 때까지 바늘을 전진시킵니다.

그런 다음 50마이크로리터 마이크로 주사기를 사용하여 AAV9-UBI-GFP 바이러스를 연막하 공간에 주입합니다. AAV9-UBI-GFP 주사가 완료된 후 연막하 공간에서 주사 바늘을 제거합니다. 플루오로 모노필라멘트 봉합사와 수술용 클립을 사용하여 근육과 피부를 봉합합니다. 깨끗한 케이지에 가두기 전에 동물이 가열 패드에서 회복되도록 하십시오.