July 9th, 2011
형광단 개발 및 이미징 기술, 바이러스가 바이러스와 세포 사이의 초기 상호 작용을 시각화하기 위해 고안되었다 뎅그열의 알렉사 플루어 라벨링의 간단한 방법에있는 발전을 활용.
이 실험의 전반적인 목적은 현미경 연구를 위해 뎅기열 바이러스를 형광 표지하는 것입니다. 필요한 완충액을 준비하고 자당 쿠션으로 뎅기열 바이러스를 정제하고 Amy React Alexa 흐름 염료 및 뎅기 바이러스를 라벨링 완충액에서 재구성합니다. 뎅기열 바이러스에 100마이크로몰의 Alexa flow를 표시합니다.
1시간 동안 죽고 하위 시약으로 라벨링 반응을 중지합니다. 크기 배제 컬럼을 통해 라벨 뎅기열 바이러스를 정제합니다. 플라크 분석으로 표지된 바이러스를 재현하고 면역형광 분석으로 표지 정도를 추정합니다.
안녕하세요, 저는 NUS 의과대학 졸업 후 Dr.Wee의 연구실에서 신종 감염병 프로그램을 담당하고 있는 DSO 국립연구소의 Sam Jang입니다. 오늘은 이미징 연구를 위해 Amy Reactive Alexa 독감 염료로 Denki 바이러스를 형광 표지하는 방법을 보여 드리겠습니다. Alexa, 독감 사망은 안정성이 우수하고 fluorescein 및 rumine 작업과 같은 일반적인 식단보다 pH에 덜 민감하여 바이러스의 세포 흡수 및 엔도솜 수송에 대한 연구에 이상적입니다.
Alexa 결함으로 표시된 뎅기열 바이러스는 뎅기열 발병 기전에 대한 이해를 용이하게 합니다. 시작하겠습니다. 라벨링 반응 전에 새로운 라벨링 버퍼를 준비하고 서면 프로토콜에 따라 시약을 중지하고 자당 쿠션으로 뎅기열 바이러스를 정제하고 마이크로 원심분리기 튜브의 라벨링 버퍼에 정제된 뎅기열 바이러스의 적절한 부피를 추가하여 밀리리터당 3억 성형 단위의 농도를 달성합니다.
이는 비례적으로 확장될 수 있습니다. 바이러스의 배치 라벨링용. 라벨링 반응 직전에 동결건조된 Alexa 바닥 염료를 라벨링 버퍼에서 1밀리몰로 재구성합니다.
이 단계부터는 빛에 대한 노출을 최소화하십시오. 시연을 위해 Alexa 바닥 염료는 1밀리몰의 800마이크로리터의 빛으로부터 보호되지 않은 상태로 유지됩니다. Alexa 흐름은 마이크로 피펫 팁으로 부드럽게 저어주면서 희석된 뎅기열 바이러스로 죽습니다.
1시간 후 15분마다 부드러운 반전으로 혼합된 빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 배양하고 튜브를 잠시 원심분리합니다. 800 마이크로 리터의 하위 영역을 마이크로 피펫으로 부드럽게 응시하면서 실온에서 1 시간 더 배양합니다. 빛으로부터 보호되어 15분마다 부드럽게 반전됩니다.
그 동안, 정제 컬럼을 25ml의 HNE 완충액과 동일시합니다. 1시간 배양 후 라벨링된 바이러스를 컬럼에 적용하고 flow through 수집을 시작합니다. 열을 HNE 버퍼로 채웁니다.
라벨링된 모든 바이러스가 매트릭스에 진입하면 처음 2.5ml의 플로우 스루를 버리고 라벨링된 바이러스 분획의 다음 2mL를 수집합니다. Ecor는 섭씨 영하 80도에서 정제 된 라벨링 된 바이러스를 보았습니다. 플라크 분석으로 라벨링된 바이러스의 제목을 확인합니다.
일반적인 실험에서는 바이러스 제목이 10배 미만으로 떨어지는 것을 관찰해야 합니다. 라벨링 후, 라벨링 정도를 평가하기 위해 면역형광 분석을 수행해야 합니다. 이를 위해 혈구 분석기를 사용하여 바이러스 세포를 열거하고 성장 배지에 적절한 양의 세포를 계수하여 밀리리터 당 50, 000 세포의 밀도를 달성하십시오.
멸균 유리 덮개가 포함된 4개의 웰 플레이트에서 웰당 1ml의 바이러스 세포를 볼 수 있습니다. 자다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 밤새 세포를 배양합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 실제로 섭씨 37도에서 10분 동안 100마이크로리터 부피에 표시된 바이러스의 약 1개의 MOI를 가진 세포에서 supinator를 흡인합니다.
접종물을 제거하고 웰당 0.5ml의 PBS 완충액으로 세포를 세척합니다. Spirit은 이 절차를 디스하고 두 번 더 반복합니다. 30분 동안 실온에서 웰당 다중 높이에 대해 3%당 200마이크로리터로 셀을 고정합니다.
웰당 0.5ml의 PBS 완충액으로 세포를 세 번 세척합니다. 세포를 실온에서 30분 동안 반응 용액으로 알리십시오. 덮개 수면을 잘 분리하고 미세한 집게를 사용하여 잘
분리하십시오.덮개 가장자리를 DPing하여 과도한 액체를 배출합니다. 흰 종이에 미끄러집니다. 덮개의 셀 쪽을 놓습니다.
퍼퓸 조각에 25마이크로리터의 뎅기열 e 단백질 항체를 바르고 자십시오. 빛으로부터 보호되는 실온의 습한 챔버에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 커버 슬립을 6웰 플레이트로 옮기고 오일당 2ml의 세척 버퍼를 추가합니다.
supinate를 흡인하십시오. 마지막 세탁 후 이 세탁 단계를 두 번 더 반복합니다. 미세한 fp를 사용하여 커버 슬립을 잘 제거합니다.
덮개 가장자리를 담그어 여분의 액체를 배출하십시오. 종이 닦음에 미끄러지십시오. 덮개의 셀 쪽을 놓습니다.
25 마이크로 리터의 Alexa 바닥에서 잠을 자면 향수 한 조각에 8 개의 안티 마우스 2 차 항체가 생깁니다. 배양이 완료된 후 빛으로부터 보호되는 실온의 습한 챔버에서 45 분 동안 배양하고, 덮개 수면을 6 개의 우물 플레이트로 옮기고 마지막 세척 후 각 세척에 대해 2 밀리리터의 세척 버퍼로 세포를 세 번 세척하십시오.우물에서 뚜껑 슬립을 제거하고 이온수로 한 번 헹굽니다.
종이에 담그어 여분의 액체를 배출하십시오. 8마이크로리터의 순한 장착 용액으로 현미경 조명에 커버 슬립을 닦아 장착합니다. 장착 용액이 야간 공기를 섭씨 4도로 설정하도록 합니다.
이제 샘플을 형광 또는 컨포칼 현미경으로 시각화할 준비가 되었습니다. 커버 슬립 표면에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨리고 현미경을 고정합니다. 현미경 스테이지로 이동합니다.
현미경 대물렌즈가 이멀젼 오일과 접촉할 때까지 스테이지를 조정합니다. 선명한 이미지를 얻으려면 Zes Zen 소프트웨어를 사용하여 주변 조명을 끄십시오. 현미경의 접안렌즈를 통해 샘플을 직접 관찰하기 위해 안구 탭을 클릭하십시오.
셀로 칠을 찾아 초점을 조정합니다. 이제 획득 모드로 전환합니다. 꽃이 떨어지는 것 사이의 누화를 최소화하려면 Alexa floor 4, 8, 8 및 finite four에 대해 별도의 트랙을 선택하십시오.
Dyes and set acquisitions to sequential excitation and detection(순차적 여기 및 검출에 대한 획득을 설정합니다). 레이저 파워 게인과 오프셋을 조정하여 이미지가 과다 또는 과소 노출되지 않도록 합니다. 이미지를 캡처하고 공동 국소화 기능을 사용하여 관심 영역을 분석합니다.
중첩 계수는 Alexa Flo Dye에 의한 뎅기열 바이러스의 표지 정도를 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 바이러스 세포에 대해 간단한 면역형광 분석을 수행했으며, 표지 정도는 표지된 바이러스의 공동 국소화로부터 추정할 수 있습니다.항 e 단백질, 항 항체 염색 중첩 계수 범위는 0.65 - 0.8이며, 이는 분산의 약 65 - 80%가 Alexa 바닥 염료로 표지되었음을 시사합니다. 라벨링 절차가 성공하려면 라벨링 버퍼를 준비하고 새로 시작하여 라벨링 전에 Alexa 플로어 다이제스트를 재구성하는 것이 중요합니다.
사용할 염료의 농도는 필요에 맞게 더욱 최적화할 수 있습니다. 뎅기열 바이러스를 라벨링하는 이 방법은 잠재적으로 다른 바이러스를 라벨링하는 데 적용될 수 있습니다. 그게 다야.
시청해 주셔서 감사드리며 라벨링 실험에 행운을 빕니다.
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이 연구는 현미경 분석을 위해 Alexa Fluor을 사용하여 뎅기 바이러스를 형광 표지하는 방법을 제시합니다. 이 접근 방식을 통해 바이러스와 숙주 세포 간의 초기 상호작용을 시각화할 수 있습니다.
Direct fluorescent labeling of dengue virus with Alexa Fluor enables precise visualization of virus-cell interactions, supporting early-stage mechanistic studies in infectious disease research. This capability enhances predictive confidence in target validation and informs translational strategies for antiviral and vaccine development. The method's compatibility with live virus and quantitative imaging strengthens its value across discovery and preclinical inflection points.
This labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis-driven studies, assay development, and translational research on viral pathogenesis.