Name: 알렉사 플루어 라벨링을 통해 뎅그열 바이러스를 떠올리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 뎅기 바이러스를 Alexa Fluor로 형광 라벨링하여 숙주 세포와의 상호작용을 현미경으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 바이러스 감염 초기 단계 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 의학 연구위원회, 싱가포르에 의해 재정 지원되었다.

1. 뎅그열 바이러스의 알렉사 플루어 라벨링 <ol><li> 라벨 반응하기 전에, 자당 쿠션과 뎅그열 바이러스를 정화하고 같은 프로토콜에 표시된 필요한 시약과 장비를 준비합니다. </li><li> 라벨 및 필터 주사기 0.2μm 필터를 소독 바로 앞에 신선한 0.2M 나트륨 중탄산염 버퍼, pH를 8.5 (라벨 버퍼) 및 히드록 실 아민 1.5M 버퍼, 산도 8.3을 (시약을 중지) 준비합니다. </li><li> 2ml 튜브에 버퍼를 라벨링의 1ml에 뎅그열 바이러스를 정화 약 3x10 8 플라크 형성 단위 (pfu)를 희석. 이것은 바이러스의 일괄 라벨에 대한 비례까지 확장할 수 있습니다. </li><li> Reconstitute 동결 건조된 알렉사 플루어 594 (AF594) 전에 라벨 반응 즉시 버퍼를 라벨에 1mM로 succinimidyl 에스테르. 알렉사 플루어 염료 시리즈에서 다른 fluorochromes 하나의 필요에 따라 사용할 수 있습니다. 이 단계 이후 조명에 노출을 최소화합니다. </li><li> 피펫 팁로 부드럽게 교반하면서 희석 바이러스에 1mM AF594 염료의 100μl를 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 1 시간을 위해 실내 온도에서 상표 반응 믹스를 품어. 부드러운 뒤집어 모든 15mins로 섞는다. </li><li> 테이블탑 원심 분리기에서 튜브 잠시 돌려 및 피펫 팁로 부드럽게 교반하면서 반응 혼합물을 중지 시약의 100μl를 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 추가 시간 동안 실온에서 품어. 부드러운 뒤집어 모든 15mins로 섞는다. </li></ol> 2. 퓨리화잉 알렉사 플루어는 뎅그열 바이러스를 분류 <ol><li> 그 동안에, 선택의 버퍼와 정화 열 평형. 본 실험에서는 PD - 10 컬럼 HNE 버퍼의 25ml (5mM Hepes, 150mM NaCl, 0.1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 사용하기 전에 산도 7.4과 equilibrated 있습니다. </li><li> 칼럼의 맨 위에 표시된 바이러스를 적용하고 표시된 바이러스가 매트릭스를 입력 한때를 통해 흐름을 모으기 시작합니다. 모든 레이블이 붙은 바이러스가 매트릭스를 입력한 후에는 HNE 버퍼로 열을 채웁니다. 흐름을 통해 첫 2.5ml를 버리고 표시된 바이러스 분율의 다음 2ml를 수집합니다. </li><li> -80에서 AF594 표시 뎅그열 바이러스를 정화 나누어지는하고 저장 ° C, 거리 광원에서. </li></ol><ol><li> 한 나누어지는를 해동 및 레이블 바이러스의 배치를 사용하기 전에 상패 분석​​에 의해 표시된 바이러스의 titer를 결정한다. </li><li> 감염 전에 잘 하루의 하단에 coverslip과 4 잘 판에서 M - 199 성장 매체 재배 종자 베로 세포의 5x10 4 당 음,. </li><li> 37 우물에 문화의 표면에 뜨는를 제거하고 10 분 대한 100μl 볼륨 (필요에 따라 M - 199 유지 보수 매체 희석)에 표시 바이러스 1 감염의 다중성으로 세포를 감염 ° C. </li><li> inoculums를 제거하고 1xPBS에 두 coverslips 씻으십시오. </li><li> 30 분 3 %의 paraformalydehyde에있는 세포를 수정. </li><li> 1xPBS에 coverslips 3 번 씻으십시오. </li><li> 30 분 대한 1xPBS에서 0.1 %의 사포닌 및 5 % BSA가 포함된 permeabilization 솔루션 세포 Permeabilize. </li><li> 로 세포를 품어 undiluted 원심 분리 - 명확히, 습기 챔버에서 1 시간에 대한 단클론 항체 3H5의 하이 브리 도마 문화 뜨는 빛으로부터 보호. </li><li> (1xPBS는 1mM의 염화칼슘, 1mM 마그네슘 염화물 및 0.1 %의 사포닌을 포함) 씻어 버퍼에 coverslips 3 번 씻으십시오. </li><li> AF488 안티 - 마우스 IgG 항체와 세포를 품어, 1:100은 빛으로부터 보호 습한 실내에 45mins를위한, permeabilization 솔루션 희석. </li><li> 세척 버퍼에 coverslips 3 번 씻고 탈이온수에 한 번 씻어. </li><li> DAB 8μl Mowiol 4-88 포함된 2.5 %의 Dabco로 초과 물을 배수하고 유리 슬라이드에 마운트 종이 타월에 대한 coverslip의 가장자리. </li><li> 자이스 혈구 공촛점 현미경을 사용하여 볼 전에 4 하룻밤 설정 장착 솔루션 ° C를 허용합니다. 순차 인수는 concomitantly 감지기 사이의 시간과 스위칭에 흥미로운 한 형광단을 수행하여야한다. </li><li> 이미지는 다음 라벨의 정도를 추정하기 위해 자이스 혈구 LSM 선 (禅) 소프트웨어를 사용하여 표시된 바이러스와 E 단백질 항체 얼룩의 공동 지방화에 대해 분석하고 있습니다. </li></ol> 3. 대표 결과 AF594 염색으로 표시 뎅그열 바이러스의 수율의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 일반적으로 초기 titer 10 배 드롭 미만은 성공적인 라벨링 다음과 같은 관찰해야합니다. 그러나, 모든 버퍼가 성공하고 그들이 수성 솔루션 8 nonreactive 무료 지방산으로 hydrolyze로 알렉사 플루어 succinimidyl의 에스테르가 reconstitution 즉시 사용해야 라벨에 대한 신선한 준비하는 것을인지해야합니다. 다음, 라벨이 바이러스는 실험에 사용하기 전에 충분한 형광 검사되어야한다. 간단한 immunofluorescence 분석은 베로 세포에서 수행되었으며 라벨의 정도는 안티 - E 단백질 항체 얼룩으로 표시된 바이러스의 공동 지방화의 추정 수 있습니다. 끊다앨 세포 검사되었으며 전형적인 공촛점 이미지가 그림 3에 표시됩니다. virions 약 65-80%이 염료와 함께 레이블 것을 제안, 0.65에서 0.8에 이르기까지 계수를 중복 보여주 LSM 선종 소프트웨어를 사용하여 이미지의 공동 지방화 분석. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1.Overall 체계는 뎅그열 바이러스 절차의 알렉사 플루어 염료 라벨을 묘사한. 첫째, 해당 버퍼 및 정화 뎅그열 바이러스가 준비하고 있습니다. 알렉사 플루어 염료는 재구성하고 버퍼를 라벨에 희석 뎅그열 바이러스에 추가됩니다. 반응은 다음 중지 시약의 추가 1 시간 후에 중지됩니다. 이후, 레이블 바이러스 무료 염료를 제거하는 크기 제외 칼럼을 통해 정화됩니다. 마지막으로, 표시된 바이러스는 플라크의 분석에 의해 다시 titrated와 형광을위한 테스트입니다. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 로 AF594 분류 전후 상패 분석 결정 가능한 virions (pfu / ML)의 번호를 의미합니다. AF594 표시 뎅그열 바이러스의 나누어지는는 해동 후 다시 titrated 상패 분석에 의해 그것은 일반적으로 이하의 10 배 드롭로부터 표시합니다 시작 titer. 오류 막대는 중복의 표준 편차를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 이전 일 coverslips에 성장 베로 세포에서 뎅그열 바이러스 E 단백질과 AF594 레이블의 공동 지방화. 전지는 37 10 분 1 뫄에서 AF594 표시된 뎅그열 감염된 ° C. 세포는 그 후에 고정 및 안티 - E 항체로 분류하고, E 단백질의 colocalization (녹색) 및 AF594 라벨 (적색)을 검사했다. 형광 신호는 자이스 혈구 LSM 710 공촛점 현미경을 사용하여 63X 배율에 따라 시각되었습니다. 스케일 바 10μm이다. 삽입된 페이지의 그림과 같이 노란색은 colocalization의 영역을 나타냅니다.

<ol><li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &amp, Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluorescent+Protein+Color+Palette%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
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<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li>
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</ol>

AF594 염료가이 보고서에 사용했지만, 알렉사 플루어 succinimidyl의 에스테르 시리즈 fluorophores 다양한 유사한 상표 화학 사용할 수 있습니다. 이 영상 이외 라벨 응용 프로그램을 확장할 수 있습니다. 유동세포계측법는 흥분과 외과 기계가 감지할 수 fluorophores에 대한 상표의 정도를 계산하는 공촛점 현미경의 대안으로 사용할 수 있습니다. 알렉사 플루어의 염료는 무료 아미노 그룹, 주로 아르기닌과 리신 9 정상적으로 바깥쪽 단백질 잔류물을 마주와 반응 작은 분자 수 있습니다. 알렉사 플루어 594 염료의 100μM과 뎅그열 바이러스 우리의 실험실, 활용에서 바이러스 titer에서 최소한의 손실과 이미지에 대한 충분한 밝기를 제공했습니다. 다른 밝기는 사용 염료의 농도를 변화하여 얻을 수 있습니다. 그러나, 염료 농도를 증가하는 것은 바이러스 생존 7,10를 줄일 수 있습니다. 한 가지 제한 fluorophor...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 히드록 실 아민 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 </td><td> 머크 </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 succinimidyl 에스테르 </td><td> 분자 프로브, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD - 10 컬럼 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M - 199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11,150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4 - 잘 플레이트 </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> Einst </td><td> 0,111,520 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 슬라이드 </td><td> 브랜드 세일 </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 하이 브리 도마 </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 첫번째 자료 </td><td> BUF - 2040 - 10X1L </td><td></td></tr><tr><td> 사포닌 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> 염화칼슘 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> 테이블탑 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> M - 199 성장 매체를 준비하려면, 나트륨 pyruvate와 M - 199, 살균 필터의 500ml에 중요하지 않은 아미노산 5ml의 5ml, FBS의 50ml를 추가합니다. M - 199 유지 보수 매체를 준비하려면, FBS의 15ml 나트륨 pyruvate와 M - 199, 살균 필터의 500ml에 중요하지 않은 아미노산 5ml의 5ml를 추가합니다.

알렉사 플루어 라벨링을 통해 뎅그열 바이러스를 떠올리

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

바이러스와 세포 사이의 상호 작용의 초기 이벤트는 감염의 결과에 지대한 영향을 가질 수 있습니다. 이 상호 작용에 영향을 미치는 요인을 결정하는 것은 질병 pathogenesis 개선 이해로 이어질 때문에 예방이나 치료 설계에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서,이 상호 작용을 조사하는 방법의 개발이 유용할 것입니다. fluorophores 개발 1-3 및 이미징 기술 4 최근 발전은 뎅그열 pathogenesis에 대한 현재의 지식을 개선하기 때문에 매년 발생하는 뎅그열 감염의 수백만을 줄이기 위해 방법을 포장에 이용하실 수 있습니다. 싸여 뎅그열 바이러스는 단일 가닥 RNA 긍정적인 게놈 5가 들어있는 nucleocapsid 껍질을 보호 90 봉투 당단백질 (E) dimers 구성된 외부 비계를 타고있다. 바이러스 표면에 동일한 단백질 subunits 따라서 아민 반응 염료로 분류하고 immunofluorescent 현미경을 통해 시각 수 있습니다. 여기, 우리는 알렉사 플루어 succinimidyl 에스테르 염색가 라벨 후 높은 가능한 바이러스를 굴복 나트륨 중탄산염 버퍼에 직접 용해와 뎅그열 바이러스의 라벨링의 간단한 방법을 제시한다. 라이브 바이러스 및 단백질 라벨은 보통 디메틸 sulfoxide의 색소의 reconstitution을 필요로 기존 제조 업체의 프로토콜의 라벨에 대한 표준화된 절차가 없습니다. 디메틸 sulfoxide의 존재, 심지어 분 수량에 바이러스의 생산 감염을 차단하고 또한 세포 세포 독성 6 유발 수 있습니다. 이 프로토콜의 디메틸 sulfoxide의 사용의 배제 따라서이 가능성을 감소. 알렉사 플루어의 염료가 우수한 photostability을 가지고 있으며 세포 이해와 바이러스의 endosomal 교통 연구에 이상적, 낮은 산도에 민감한 등 플루오레신와 rhodamine이 같은 일반적인 염료보다됩니다. 알렉사 플루어 염료의 활용은 바이러스 특정 항체 및 호스트 세포 7의 putative 수용체에 의해 표시 뎅그열 바이러스의 인식에 영향을주지 않았다. 이 방법은 virological 공부에 유용한 응용 프로그램을 수 있습니다.

형광단 개발 및 이미징 기술, 바이러스가 바이러스와 세포 사이의 초기 상호 작용을 시각화하기 위해 고안되었다 뎅그열의 알렉사 플루어 라벨링의 간단한 방법에있는 발전을 활용.

바이러스와 세포 간 상호작용의 초기 단계는 감염 결과에 지대한 영향을 미칠 수 있습니다. ...하는 요인들을 결정하는 것은

이 실험의 전체적인 목적은 현미경 연구를 위해 뎅기 바이러스를 형광 표지하는 것입니다. 필요한 완충액을 준비하고 수크로스 쿠션을 이용하여 뎅기 바이러스를 정제한 후, 표지 완충액에서 Amy React Alexa flow 염료와 뎅기 바이러스를 재구성합니다. 100 µM의 Alexa flow를 사용하여 뎅기 바이러스를 표지합니다.1시간 동안 반응시킨 후 부 반응물(sub reagent)을 사용하여 라벨링 반응을 중단시킵니다. 크기 배제 컬럼(size exclusion column)을 통해 라벨링된 뎅기 바이러스를 정제합니다. 플라크 분석(plaque assay)으로 라벨링된 바이러스의 농도를 다시 측정하고, 면역형광 분석(immunofluorescence assay)을 통해 라벨링 정도를 추정합니다.안녕하세요, 저는 NUS 대학원 의과대학을 졸업하고 현재 DSO 국립 연구소의 Wee 박사님 연구실에서 신종 감염병 프로그램을 연구하고 있는 샘 장(Sam Jang)입니다. 오늘은 이미지 연구를 위해 아민 반응성 Alexa 형광 염료(Amy Reactive Alexa flu dye)를 사용하여 덴키 바이러스(Denki virus)를 형광 표지하는 방법을 보여드리겠습니다. Alexa 형광 염료는 플루오레세인(fluorescein)이나 로다민(rhodamine)과 같은 일반적인 염료보다 안정성이 뛰어나고 pH 민감도가 낮아, 바이러스의 세포 내 흡수 및 엔도좀 수송 연구에 이상적입니다.Alexa fluor가 표지된 뎅기 바이러스는 뎅기열의 병태생리 이해를 도울 것입니다. 이제 시작해 보겠습니다. 표지 반응 전, 작성된 프로토콜에 따라 신선한 표지 버퍼와 정지 시약을 준비하고, 수크로스 쿠션법으로 뎅기 바이러스를 정제하십시오. 그 후, 정제된 뎅기 바이러스의 적절한 부피를 마이크로 원심분리 튜브 내의 표지 버퍼에 추가하여 300 million forming units per milliliter의 농도가 되도록 합니다.이는 비례하여 규모를 확장할 수 있습니다. 바이러스의 배치 라벨링(batch labeling)을 위해, 라벨링 반응 직전에 동결건조된 Alexa floor dye를 라벨링 완충액으로 1 mM 농도로 재구성하십시오.이 단계부터 빛 노출을 최소화하십시오. 시연 목적으로 Alexa flow dye는 빛 차단을 하지 않은 상태로 둡니다. 마이크로 피펫 팁으로 부드럽게 저으면서 1 mM Alexa flow dye 800 µL를 희석된 뎅기 바이러스에 첨가합니다.빛이 차단된 실온에서 1시간 동안 배양하며, 15분마다 부드럽게 전도 혼합합니다. 1시간 후, 튜브를 짧게 원심 분리합니다. 마이크로 피펫으로 부드럽게 섞으면서 하위 영역의 800 µL를 취한 뒤, 빛이 차단된 실온에서 1시간 더 배양합니다. 이때 15분마다 부드럽게 전도 혼합합니다.그동안 정제 컬럼을 25 milliliters의 HNE buffer로 평형화합니다. 1시간의 배양 후, 표지된 바이러스를 컬럼에 도포하고 통과액(flow through)을 수집하기 시작합니다. 컬럼을 HNE buffer로 채웁니다.표지된 바이러스가 모두 매트릭스에 진입하면, 처음 2.5 mL의 통과액은 버리고 그다음 2 mL의 표지 바이러스 분획을 수집하십시오. 정제된 표지 바이러스를 -80 °C에서 급속 냉동 및 보관하십시오. 플라크 분석법을 통해 표지 바이러스의 타이터를 측정하십시오.전형적인 실험에서 바이러스 역가(virus title)의 감소 폭은 10배 미만이어야 합니다. 라벨링 후에는 면역형광 분석법(immunofluorescence assay)을 수행하여 라벨링 정도를 평가해야 합니다. 이를 위해 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 바이러스 세포 수를 측정하고, 밀도가 50,000 cells/mL가 되도록 적절한 부피의 세포를 성장 배지에 분주합니다.멸균 유리 커버가 포함된 4웰 플레이트의 웰당 1 mL의 바이러스 세포를 분주합니다. 37 °C, 5% CO2 조건의 배양기에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 배양기에서 플레이트를 꺼내고 웰에서 상층액을 흡입하여 제거합니다. 이후 100 µL 부피의 표지된 바이러스를 약 1 MOI로 세포에 처리하여 37 °C에서 10분 동안 반응시킵니다.접종액을 제거하고 웰당 0.5 milliliters의 PBS 버퍼로 세포를 세척하십시오. 이 과정을 두 번 더 반복하십시오. 실온에서 30 Minutes 동안 웰당 200 microliters의 3%per for multi height를 사용하여 세포를 고정하십시오.웰당 0.5 milliliters의 PBS 버퍼로 세포를 3회 세척합니다. 상온에서 30 Minutes 동안 고정액으로 세포를 고정합니다. 정밀 핀셋을 사용하여 웰에서 커버슬립을 제거합니다.커버의 가장자리를 DP하여 과잉 액체를 제거합니다. 거름종이(paper white)에 대고 살짝 밉니다. 커버의 셀 쪽을 배치합니다.파라필름 조각 위에 25 µL의 뎅기 e 단백질 항체를 분주합니다. 빛이 차단된 실온의 습윤 챔버에서 1시간 동안 배양합니다. 그다음, 커버슬립을 6-웰 플레이트로 옮기고 웰당 2 mL의 세척 완충액을 첨가합니다.상층액을 흡입하여 제거합니다. 마지막 세척 후 이 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. 미세 핀셋(fine fp)을 사용하여 웰에서 커버슬립을 제거합니다.커버의 가장자리를 살짝 들어 올려 과잉 액체를 제거합니다. 종이 와이프로 닦아냅니다. 커버의 셀 쪽을 배치합니다.파라필름 조각 위에 Alexa Fluor 488 anti-mouse 2차 항체 25 µL를 분주합니다. 빛이 차단된 상온의 습윤 챔버에서 45분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 커버슬립을 6-웰 플레이트로 옮기고, 각 세척 단계마다 2 mL의 세척 완충액으로 세포를 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 웰에서 커버슬립을 꺼내 이온화수(ionized water)로 1회 헹굽니다.거름종이에 흡수시켜 과잉 액체를 제거합니다. 8 µL의 약한 마운팅 용액을 사용하여 커버슬립을 현미경 슬라이드 위에 마운트합니다. 마운팅 용액이 4 °C에서 하룻밤 동안 공기 중에서 굳도록 둡니다.이제 샘플을 형광 현미경 또는 공초점 현미경으로 관찰할 준비가 되었습니다. 커버슬립 표면에 침유를 소량 떨어뜨린 후 현미경을 고정하십시오. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓으십시오.현미경 대물렌즈가 침유에 닿을 때까지 스테이지를 조절하십시오. 선명한 이미지를 얻으려면 Zeiss Zen 소프트웨어를 사용하여 주변 조명을 끄십시오. 현미경 접안렌즈를 통해 샘플을 직접 관찰하려면 ocular 탭을 클릭하십시오.세포가 있는 필드를 찾아 초점을 조절합니다. 이제 획득 모드로 전환합니다. 형광 채널 간의 크로스토크를 최소화하기 위해 Alexa Fluor 488과 DAPI에 각각 별도의 트랙을 선택합니다.염료와 설정값을 순차적 여기 및 검출에 맞게 조정합니다. 이미지가 과노출되거나 저노출되지 않도록 레이저 출력의 이득(gain)과 오프셋(offset)을 조정하십시오. 이미지를 캡처하고 공국소화(colocalization) 기능을 사용하여 관심 영역을 분석합니다.중첩 계수를 사용하여 Alexa Flo Dye에 의한 뎅기 바이러스의 표지 정도를 추정할 수 있습니다. 바이러스 세포에 대해 간단한 면역형광 분석을 수행하였으며, 표지된 바이러스와 anti e 단백질, anti 항체 염색의 공국소화(colocalization)를 통해 표지 정도를 추정할 수 있습니다. 중첩 계수가 0.65에서 0.8 범위로 나타나, 변이체의 약 65%에서 80%가 Alexa Flo Dye로 표지되었음을 시사합니다. 표지 절차가 성공하기 위해서는 표지 버퍼를 준비하고, 신선한 시약을 사용하며, 표지 전에 Alexa Flo Dye를 재구성하는 것이 중요합니다.사용할 염료의 농도는 필요에 따라 추가로 최적화할 수 있습니다. 뎅기 바이러스를 수평 라벨링하는 이 방법은 다른 바이러스를 라벨링하는 데에도 잠재적으로 응용될 수 있습니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사합니다. 라벨링 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

기능 - 스페이서 - 지질 (FSL) 구조는 살아있는 세포와 virions의 표면 특성은 활력의 손실없이 수정할 수 있도록. 방법은 세포 / virion 및 자발하고 안정적​​인 표면 설립 발생과 FSL 구조 솔루션의 단순한 접촉을 필요로합니다.

FSL은 구조 : 생물 학적 마커의 범위와 셀 / Virion 표면을 수정하기위한 간단한 방법을 자신의 생존에 영향을주지 않고

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

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Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

출처: Zaeck, L., et al. 용매 세척 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징. J. Vis. Exp. (2019).  이 비디오는 감염 진행을 평가하기 위해 광견병 바이러스(RABV)에 감염된 쥐의 뇌 조직을 준비하고 이미징하는 과정을 보여줍니다. 형광 마커를 사용한 조직 염색, 탈수, 투명화, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 검사를 위한 장착을 포함한 주요 단계를 간략하게 설명하여 3차원 표현을 생성하는 것으로 마무리합니다.

쥐 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 3차원 시각화

표면에 비리온의 부착은 슈퍼 해상도 형광 화상 진찰 또는 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의한 단일 virion 화상 진찰을 위한 요구 사항입니다. 여기서 우리는 AFM 및 초분해능 형광 이미징에 사용하기에 적합한 유리 표면에 대한 비온의 제어 접착을 위한 샘플 준비 방법을 시연한다.

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

바이러스 또는 세포외 소포체는 표면 항원을 인식하는 항체에 결합된 15nm 자성 나노입자로 면역포획되었습니다. 포획된 비리온 또는 소포는 다른 표면 항원에 대한 형광 항체로 표지되었습니다. 그 결과로 생성된 복합체는 높은 자기장에서 분리되고 형광에 트리거된 기존 유세포 분석기로 분석되었습니다.

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

여기서 우리는 RNA 망고 aptamers I, II, III, 또는 IV로 태그된 RNA를 이미지화하기 위해 민감하고, 신속하며, 차별적인 포스트 겔 염색 방법을 제시하고, 네이티브 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔을 사용한다. 표준 PAGE 젤을 실행한 후 망고 태그RNA는 TO1-Biotin으로 쉽게 염색한 다음 일반적으로 사용할 수 있는 형광 리더를 사용하여 분석할 수 있습니다.

포스트스테인링 방법을 통해 폴리아크릴아미드 겔에서 망고 태그RNA의 형광 시각화

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

여기서, 우리는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RNA를 시각화하기 위하여 정시 혼성화 (RNA-FISH)와 면역형광에 있는 RNA 형광을 결합하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 SARS-CoV-2 RNA 숙주 상호 작용의 분자 특성에 대한 이해를 증가시킬 수 있다.

시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화

여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

배우세요 뎅기 바이러스를 Alexa Fluor로 형광 라벨링하여 숙주 세포와의 상호작용을 현미경으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 바이러스 감염 초기 단계 연구에 활용됩니다.

알렉사 플루어 라벨링을 통해 뎅그열 바이러스를 떠올리

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