알렉사 플루어 라벨링을 통해 뎅그열 바이러스를 떠올리

이 실험의 전체적인 목적은 현미경 연구를 위해 뎅기 바이러스를 형광 표지하는 것입니다. 필요한 완충액을 준비하고 수크로스 쿠션을 이용하여 뎅기 바이러스를 정제한 후, 표지 완충액에서 Amy React Alexa flow 염료와 뎅기 바이러스를 재구성합니다. 100 µM의 Alexa flow를 사용하여 뎅기 바이러스를 표지합니다.

1시간 동안 반응시킨 후 부 반응물(sub reagent)을 사용하여 라벨링 반응을 중단시킵니다. 크기 배제 컬럼(size exclusion column)을 통해 라벨링된 뎅기 바이러스를 정제합니다. 플라크 분석(plaque assay)으로 라벨링된 바이러스의 농도를 다시 측정하고, 면역형광 분석(immunofluorescence assay)을 통해 라벨링 정도를 추정합니다.

안녕하세요, 저는 NUS 대학원 의과대학을 졸업하고 현재 DSO 국립 연구소의 Wee 박사님 연구실에서 신종 감염병 프로그램을 연구하고 있는 샘 장(Sam Jang)입니다. 오늘은 이미지 연구를 위해 아민 반응성 Alexa 형광 염료(Amy Reactive Alexa flu dye)를 사용하여 덴키 바이러스(Denki virus)를 형광 표지하는 방법을 보여드리겠습니다. Alexa 형광 염료는 플루오레세인(fluorescein)이나 로다민(rhodamine)과 같은 일반적인 염료보다 안정성이 뛰어나고 pH 민감도가 낮아, 바이러스의 세포 내 흡수 및 엔도좀 수송 연구에 이상적입니다.

Alexa fluor가 표지된 뎅기 바이러스는 뎅기열의 병태생리 이해를 도울 것입니다. 이제 시작해 보겠습니다. 표지 반응 전, 작성된 프로토콜에 따라 신선한 표지 버퍼와 정지 시약을 준비하고, 수크로스 쿠션법으로 뎅기 바이러스를 정제하십시오. 그 후, 정제된 뎅기 바이러스의 적절한 부피를 마이크로 원심분리 튜브 내의 표지 버퍼에 추가하여 300 million forming units per milliliter의 농도가 되도록 합니다.

이는 비례하여 규모를 확장할 수 있습니다. 바이러스의 배치 라벨링(batch labeling)을 위해, 라벨링 반응 직전에 동결건조된 Alexa floor dye를 라벨링 완충액으로 1 mM 농도로 재구성하십시오.

이 단계부터 빛 노출을 최소화하십시오. 시연 목적으로 Alexa flow dye는 빛 차단을 하지 않은 상태로 둡니다. 마이크로 피펫 팁으로 부드럽게 저으면서 1 mM Alexa flow dye 800 µL를 희석된 뎅기 바이러스에 첨가합니다.

빛이 차단된 실온에서 1시간 동안 배양하며, 15분마다 부드럽게 전도 혼합합니다. 1시간 후, 튜브를 짧게 원심 분리합니다. 마이크로 피펫으로 부드럽게 섞으면서 하위 영역의 800 µL를 취한 뒤, 빛이 차단된 실온에서 1시간 더 배양합니다. 이때 15분마다 부드럽게 전도 혼합합니다.

그동안 정제 컬럼을 25 milliliters의 HNE buffer로 평형화합니다. 1시간의 배양 후, 표지된 바이러스를 컬럼에 도포하고 통과액(flow through)을 수집하기 시작합니다. 컬럼을 HNE buffer로 채웁니다.

표지된 바이러스가 모두 매트릭스에 진입하면, 처음 2.5 mL의 통과액은 버리고 그다음 2 mL의 표지 바이러스 분획을 수집하십시오. 정제된 표지 바이러스를 -80 °C에서 급속 냉동 및 보관하십시오. 플라크 분석법을 통해 표지 바이러스의 타이터를 측정하십시오.

전형적인 실험에서 바이러스 역가(virus title)의 감소 폭은 10배 미만이어야 합니다. 라벨링 후에는 면역형광 분석법(immunofluorescence assay)을 수행하여 라벨링 정도를 평가해야 합니다. 이를 위해 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 바이러스 세포 수를 측정하고, 밀도가 50,000 cells/mL가 되도록 적절한 부피의 세포를 성장 배지에 분주합니다.

멸균 유리 커버가 포함된 4웰 플레이트의 웰당 1 mL의 바이러스 세포를 분주합니다. 37 °C, 5% CO2 조건의 배양기에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 배양기에서 플레이트를 꺼내고 웰에서 상층액을 흡입하여 제거합니다. 이후 100 µL 부피의 표지된 바이러스를 약 1 MOI로 세포에 처리하여 37 °C에서 10분 동안 반응시킵니다.

접종액을 제거하고 웰당 0.5 milliliters의 PBS 버퍼로 세포를 세척하십시오. 이 과정을 두 번 더 반복하십시오. 실온에서 30 Minutes 동안 웰당 200 microliters의 3%per for multi height를 사용하여 세포를 고정하십시오.

웰당 0.5 milliliters의 PBS 버퍼로 세포를 3회 세척합니다. 상온에서 30 Minutes 동안 고정액으로 세포를 고정합니다. 정밀 핀셋을 사용하여 웰에서 커버슬립을 제거합니다.

커버의 가장자리를 DP하여 과잉 액체를 제거합니다. 거름종이(paper white)에 대고 살짝 밉니다. 커버의 셀 쪽을 배치합니다.

파라필름 조각 위에 25 µL의 뎅기 e 단백질 항체를 분주합니다. 빛이 차단된 실온의 습윤 챔버에서 1시간 동안 배양합니다. 그다음, 커버슬립을 6-웰 플레이트로 옮기고 웰당 2 mL의 세척 완충액을 첨가합니다.

상층액을 흡입하여 제거합니다. 마지막 세척 후 이 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. 미세 핀셋(fine fp)을 사용하여 웰에서 커버슬립을 제거합니다.

커버의 가장자리를 살짝 들어 올려 과잉 액체를 제거합니다. 종이 와이프로 닦아냅니다. 커버의 셀 쪽을 배치합니다.

파라필름 조각 위에 Alexa Fluor 488 anti-mouse 2차 항체 25 µL를 분주합니다. 빛이 차단된 상온의 습윤 챔버에서 45분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 커버슬립을 6-웰 플레이트로 옮기고, 각 세척 단계마다 2 mL의 세척 완충액으로 세포를 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 웰에서 커버슬립을 꺼내 이온화수(ionized water)로 1회 헹굽니다.

거름종이에 흡수시켜 과잉 액체를 제거합니다. 8 µL의 약한 마운팅 용액을 사용하여 커버슬립을 현미경 슬라이드 위에 마운트합니다. 마운팅 용액이 4 °C에서 하룻밤 동안 공기 중에서 굳도록 둡니다.

이제 샘플을 형광 현미경 또는 공초점 현미경으로 관찰할 준비가 되었습니다. 커버슬립 표면에 침유를 소량 떨어뜨린 후 현미경을 고정하십시오. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓으십시오.

현미경 대물렌즈가 침유에 닿을 때까지 스테이지를 조절하십시오. 선명한 이미지를 얻으려면 Zeiss Zen 소프트웨어를 사용하여 주변 조명을 끄십시오. 현미경 접안렌즈를 통해 샘플을 직접 관찰하려면 ocular 탭을 클릭하십시오.

세포가 있는 필드를 찾아 초점을 조절합니다. 이제 획득 모드로 전환합니다. 형광 채널 간의 크로스토크를 최소화하기 위해 Alexa Fluor 488과 DAPI에 각각 별도의 트랙을 선택합니다.

염료와 설정값을 순차적 여기 및 검출에 맞게 조정합니다. 이미지가 과노출되거나 저노출되지 않도록 레이저 출력의 이득(gain)과 오프셋(offset)을 조정하십시오. 이미지를 캡처하고 공국소화(colocalization) 기능을 사용하여 관심 영역을 분석합니다.

중첩 계수를 사용하여 Alexa Flo Dye에 의한 뎅기 바이러스의 표지 정도를 추정할 수 있습니다. 바이러스 세포에 대해 간단한 면역형광 분석을 수행하였으며, 표지된 바이러스와 anti e 단백질, anti 항체 염색의 공국소화(colocalization)를 통해 표지 정도를 추정할 수 있습니다. 중첩 계수가 0.65에서 0.8 범위로 나타나, 변이체의 약 65%에서 80%가 Alexa Flo Dye로 표지되었음을 시사합니다. 표지 절차가 성공하기 위해서는 표지 버퍼를 준비하고, 신선한 시약을 사용하며, 표지 전에 Alexa Flo Dye를 재구성하는 것이 중요합니다.

사용할 염료의 농도는 필요에 따라 추가로 최적화할 수 있습니다. 뎅기 바이러스를 수평 라벨링하는 이 방법은 다른 바이러스를 라벨링하는 데에도 잠재적으로 응용될 수 있습니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 라벨링 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.