의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

이 절차의 전반적인 목표는 아황산염으로 변환된 DNA의 게놈 염기서열분석을 통해 CPG 디뉴클레오티드의 DNA 메틸화 분석을 가능하게 하는 것입니다. 이것은 먼저 이중 가닥 DNA인 변성에 의해 수행되어 중아황산염 전환 반응이 일어날 수 있습니다. 두 번째 단계는 게놈 DNA의 모든 메틸화되지 않은 사이토신을 바이 아황산염 탈아미노화에 의해 우라실로 전환하는 것입니다.

이 반응에는 세 단계가 포함됩니다. 첫 번째는 5 6 이중 결합에 B 아황산염을 첨가하여 시토신 잔기를 황화하는 것입니다. 둘째, 아황산염 유도체에 의한 시토신의 수압 탈아미노화는 아황산염 유도체에 의한 SSL을 생성하고, 셋째, 알칼리 처리에 의한 설포네이트 그룹의 제거는 SSL 잔류물을 생성합니다.

다음으로, 타겟 영역은 바이 아황산염 전환 특이적 프라이머 및 PCR 증폭에 의해 증폭됩니다. 마지막 단계는 DNA 분자 전체의 메틸화를 위한 단일 뉴클레오티드 분해능을 제공하기 위해 PCR 산물의 클로닝 및 염기서열분석입니다. 궁극적으로, 결과는 산성 조건에서 중수소황산염 탈아미노화에 대한 5개의 메틸 시토신에 비해 사이토카인의 증가된 민감도를 활용하여 게놈 DNA에서 CPG 디뉴클레오티드의 DNA 메틸화를 보여줍니다.

남부 혈액 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 d 메틸화의 단일 뉴클레오티드 분리를 허용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 암과 같은 인간 질병에서 DNA 메틸화의 역할과 같은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중아황산염 변환을 위한 DNA 샘플을 준비하려면 먼저 2마이크로그램의 게놈 DNA를 중아황산염, DNA 용해 완충액 및 총 부피 18마이크로리터로 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 2마이크로리터의 갓 준비된 3몰 수산화나트륨 2마이크로리터를 0.3몰의 최종 농도에 첨가하여 게놈 DNA를 변성시킵니다. 샘플을 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 배양한 다음 섭씨 90도에서 2분 동안 배양합니다. 열 구획에서는, 즉각 5 분 동안 얼음에 관을 두고십시오, DNA가 관의 바닥에 있다는 것을 지키기 위하여 10 초, 000 Gs에 관을 원심 분리하십시오, 변성 DNA 표본은 지금 다음에 설명될 B 세포 싸움 deamination를 위해 준비되어 있습니다.

황화 및 가수분해 탈아미노화 반응 전에 아황산염 pH 5.0에 의한 10 밀리몰 퀴놀 및 포화 나트륨 메타의 새로운 용액을 준비합니다. 아황산염에 의한 나트륨 메타는 포화 용액이기 때문에 작은 덩어리가 용해되지 않은 상태로 남아 있을 수 있습니다. 아황산염 208 마이크로 리터 및 퀴놀 12 마이크로 리터에 의한 나트륨 메타를 변성 DNA 20 마이크로 리터에 최종 부피 240 마이크로 리터로 첨가합니다.

튜브와 원심 분리기를 10초 동안 소용돌이치며 모든 물방울이 튜브 바닥에 있는지 확인합니다. 샘플에 미네랄 오일을 겹쳐 놓습니다. 샘플을 섭씨 55도의 수조에서 4시간에서 16시간 동안 배양하며, 이는 변환할 DNA의 양과 품질에 따라 다릅니다.

중아황산염 변환은 산화를 피하기 위해 어둠 속에서 일어나는 것이 중요합니다. 적절한 배양 시간이 끝나면 마이크로 원심 분리기에서 튜브를 잠시 돌려 모든 액체가 튜브 바닥에 있는지 확인합니다. 그런 다음 미네랄 오일을 흡수하지 않고 튜브 바닥에서 DNA 용액을 조심스럽게 피펫으로 빼냅니다.

다음 단계에서는 promega wizard DNA 클린업 시스템을 사용합니다. DNA 샘플에 1밀리리터 수지를 첨가하고 튜브를 뒤집어 혼합한 다음 용액을 탈염 컬럼에 부착된 주사기에 피펫으로 넣습니다. 마지막으로, 유리 바이 아황산염 이온을 제거하려면 이중 아황산염 처리된 DNA를 탈염 컬럼에 통과시키고 50마이크로리터의 Milli Q 물을 암시합니다.

다음 단계는 담수화에 의해 우라실 고리에서 중아황산염 다락방을 제거하는 것입니다. 이를 위해 갓 준비한 3몰 수산화나트륨 5.5마이크로리터를 각 중아황산염 처리된 DNA 샘플에 추가하여 최종 농도 0.3몰을 만듭니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.

샘플을 잠시 원심분리한 다음 각 샘플에 1마이크로리터의 TRNA를 추가합니다. 3 어금니의 최종 농도에 아세트산 암모늄을 첨가하여 용액을 중화하십시오. 다음으로 에탄올이 DNA를 침전시킵니다.

얼음처럼 차갑게 100% 에탄올 330마이크로리터를 넣고 반전으로 잘 섞습니다. 섭씨 영하 20도에서 1시간 동안 방치하고 14, 000GS에서 15분 동안 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 원심분리기를 합니다. 그런 다음 상층액의 모든 흔적을 제거하고 침전된 DNA를 약 20분 동안 자연 건조시킵니다.

공기 건조 후, 펠릿은 거의 볼 수 없습니다 DNA 펠릿을 0.1 XTE의 50 마이크로 리터에 재현탁 또는 물이 실온에서 약 2 시간 동안이 시간 동안 방치, 때때로, DNA가 용해되도록 튜브를 소용돌이 소용돌이 이어서 빠른 원심 분리. DNA가 용해되면 DNA의 양과 질에 따라 섭씨 영하 20도에서 10년 동안 보관하거나 즉시 사용할 수 있습니다. PCR 증폭의 경우 프라이머 최적화는 이 절차에서 가장 어려운 측면입니다.

따라서 성공적인 프라이머 설계를 보장하기 위해 다음 지침이 제공됩니다. 이러한 가이드라인을 설명하기 위해, 타겟 염기서열은 아황산염으로 변환되어 서면으로 작성될 때 변환된 사이토신은 파란색 Ts로 나타나고 변환되지 않은 CPG 부위는 빨간색 cgs로 표시되며, 프라이머는 특이성을 보장하기 위해 길이가 24 - 30 염기쌍이어야 합니다. 프라이머는 섭씨 50도 이상에서 유사하게 예측된 TM을 가져야 하며 섭씨 1-2도 이상 차이가 나지 않아야 합니다.

프라이머는 변환 특이성을 보장하기 위해 약 25%C에서 T 염기를 여러 개 포함해야 합니다. 3개의 주요한 끝이 개조된 D-N-A-C-P-G 디뉴클레오티드의 확대를 지키기 위하여 T에 C이어야 하는 마지막 기초는 뇌관 순서에서 메틸화되거나 unconverted 템플렛으로 잠재적인 편향을 피하기 위하여 피해야 합니다. 그러나 불가피한 경우 CPG 부위의 시토신을 Y로 교체하여 변환된 DNA의 편향되지 않은 증폭을 보장해야 합니다.

마지막으로, 필요한 경우 PCR 반응의 특이성 또는 감도를 보장하기 위해 중첩 또는 반중첩 프라이머 세트를 설계합니다. 최적화를 위해 25 microliter 분취량에서 PCR 증폭 반응 혼합물을 준비합니다. 각 반응에는 아황산염 변환 게놈 DNA, DPS 프라이머, 염화마그네슘, 염화칼륨, 트리스 염산염, pH 8.3 anac 중합효소가 포함되어 메틸화 또는 비메틸화 물질의 증폭 바이어스를 테스트합니다.

50 50 메틸화되지 않은 메틸화되지 않은 완전 바이 아황산염 변환 대조군 샘플을 사용하여 바이 아황산염 전환으로 비례 PCR 증폭을 테스트합니다. 온도 기온변화도 thermocycler에 있는 특정한 뇌관 그리고 PCR 반응 혼합은 8개에서 10의 관을 가로질러 뇌관의 TM에서 기온변화도 더하기 또는 마이너스 3 도에 있는 뛰기 반응을 놓고, thermocycler에서 그(것)들을 두기 전에 마이크로 분리기에서 관을 와류 및 회전급강하. 이 그림은 50% 메틸화된 DNA와 메틸화되지 않은 DNA의 혼합물로부터 온도 구배 PCR 증폭 프로파일을 가진 아그로스 겔을 보여줍니다.

PCR 앰플리콘 및 T 레인 2, 5 및 8로 표시된 레인은 메틸화된 DNA만 소화하는 제한 효소로 처리되었으며, 최적의 PCR 증폭 조건은 메틸화 및 비메틸화 앰플리콘을 바이어스 없이 비율로 증폭해야 하며, 그 결과 여기에서 볼 수 있듯이 동일한 양의 cut 및 uncut PCR 산물이 생성됩니다. 비바이어스 증폭을 위한 최적의 열순환 조건은 섭씨 55.6도입니다. bi-sulfite DNA의 완전한 변환은 전환되지 않은 DNA lane 3, 6 및 9 레인 만 소화하는 cytosine site-specific 효소로 분해하여 분석 할 수 있습니다.

완전한 bi-sulfite DNA 변환은 여기에서 3 레인, 3 차선, 6 차 및 9 차 모두에 cut DNA가 없다는 것을 나타냅니다. 이 실시간 해리 플롯은 각각 섭씨 82.9도와 섭씨 86.9도에서 해리되는 완전 메틸화된 분홍색 라인 m과 메틸화되지 않은 DNA 녹색 라인 U의 대조군 증폭과 비교하여 메틸화된 DNA 빨간색 주황색 라인 50 50 50 혼합물의 동일한 비율을 보여줍니다. 이는 서로 다른 분자가 해리되는 온도에 따른 증폭 바이어스가 없음을 나타냅니다.

이중 아황산염 처리된 샘플의 증폭으로 생성된 PCR 단편은 agros gel 전기영동으로 시각화하고 염기서열분석을 수행할 수 있습니다. 여기에 직접 표시된 것은 노란색 세포주 X로 강조 표시된 CPG 부위가 있는 3개의 서로 다른 세포주에서 얻은 염기서열 추적이며, 여기서 세포주 Y와 Z는 여기에 표시된 GA 신호가 겹쳐서 볼 수 있듯이 다양한 정도의 메틸화를 나타냅니다. 그림 4 A는 CPG 부위가 노란색으로 강조 표시된 3개의 서로 다른 세포주에서 얻은 염기서열 추적입니다.

개별 클론의 직접 염기서열분석 후, 개별 분자의 메틸화 상태를 이중 아황산염 맵에서 표로 만들 수 있습니다. 이질성 메틸화를 시각화하기 위해 개별 CPG 부위의 메틸화 밀도가 빨간색으로 표시됩니다. 이 대표적인 bi-sulfite 맵에서 샘플의 고처리량 정량적 메틸화 분석.

시퀀놈 에피 타이퍼 기술을 사용하면 이 예에서 볼 수 있듯이 메틸화된 시토신의 존재에 따라 특정 스펙트럼을 생성할 수 있습니다. 그림 5 A.샘플의 비율 요약은 에피그램 형태로 외삽할 수 있습니다. 그림 5 B.이 예는 4개의 서로 다른 세포주에 대한 각 CPG 부위의 DNA 메틸화 비율을 보여줍니다. 마지막으로, 메틸화 플롯 요약 그림 5 C는 개발 후 에피그램에서 파생될 수 있습니다. 이 기술은 후성유전학 분야의 연구자들이 DNA 메틸화와 인간 질병에서의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.