의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

이 절차의 전반적인 목표는 아황산염 전환 DNA의 게놈 시퀀싱을 통해 CpG 디뉴클레오타이드의 DNA 메틸화 분석을 가능하게 하는 것입니다. 이는 먼저 이중 가닥 DNA를 변성시켜 아황산염 전환 반응이 일어날 수 있도록 함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 아황산염 탈아미노화를 통해 게놈 DNA 내의 모든 비메틸화 시토신을 우라실로 전환하는 것입니다.

이 반응은 세 단계로 진행됩니다. 첫 번째 단계는 B 아황산염을 5,6 이중 결합에 첨가하여 사이토신 잔기를 황산화하는 것입니다. 둘째로, 아황산염 유도체에 의한 사이토신의 가수분해 탈아미노화를 통해 아황산염 유도체에 의한 SSL이 생성되며, 셋째로, 알칼리 처리를 통해 설포네이트 그룹을 제거함으로써 SSL 잔기가 생성됩니다.

다음으로, 중아황산염 전환 특이적 프라이머와 PCR 증폭을 통해 표적 영역을 증폭합니다. 마지막 단계는 PCR 산물을 클로닝하고 시퀀싱하여 DNA 분자 전체의 메틸화 상태를 단일 뉴클레오티드 해상도로 분석하는 것입니다. 최종적으로, 산성 조건에서 5-methyl cytosine에 비해 cytosine이 중아황산염 탈아미노화에 더 민감하다는 점을 이용하여 게놈 DNA 내 CpG 디뉴클레오티드의 DNA 메틸화를 확인합니다.

서던 혈액 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 DNA 메틸화의 단일 뉴클레오타이드 해상도를 구현할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 암과 같은 인간 질병에서 DNA 메틸화의 역할과 같이 후성유전학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 비설파이트 전환을 위해 DNA 샘플을 준비하려면, 먼저 2 µg의 genomic DNA를 비설파이트, DNA 용해 버퍼와 함께 총 부피 18 µL가 되도록 혼합하여 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오.

그 다음, 갓 제조한 3 M 수산화나트륨 2 µL를 첨가하여 최종 농도가 0.3 M이 되도록 게놈 DNA를 변성시킵니다. 시료를 항온수조에서 37 °C로 15분 동안 배양한 후, 이어서 90 °C에서 2분 동안 배양합니다. 히트 블록에서 꺼낸 즉시 튜브를 얼음 위에 5분 동안 놓아 냉각시키고, 10,000 ×g에서 10초 동안 원심분리하여 DNA가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 이제 변성된 DNA 시료는 다음 단계에서 시연할 B 세포 비특이적 탈아미노화 반응 준비가 완료되었습니다.

황산화 및 가수분해 탈아미노 반응을 수행하기 전, 10 millimolar quinol 용액과 pH 5.0의 포화 sodium meta by sulfite 용액을 새로 준비하십시오. sodium meta by sulfite는 포화 용액이므로 작은 덩어리가 녹지 않은 채로 남아 있을 수 있습니다. 변성된 DNA 20 microliters에 sodium meta by sulfite 208 microliters와 quinol 12 microliters를 추가하여 최종 부피를 240 microliters로 맞춥니다.

튜브를 볼텍싱한 후 10초 동안 원심 분리하여 모든 액적(droplet)이 튜브 바닥에 모이도록 합니다. 샘플 위에 미네랄 오일을 덮습니다. 변환할 DNA의 양과 품질에 따라 워터 배스에서 55 °C로 4~16시간 동안 샘플을 배양합니다.

산화를 방지하기 위해 중아황산염 변환(bisulfite conversion)은 반드시 암소에서 진행해야 합니다. 적절한 배양 시간이 지나면, 모든 액체가 튜브 바닥에 모이도록 마이크로 원심분리기로 튜브를 짧게 원심분리하십시오. 그 다음, 미네랄 오일이 섞이지 않도록 주의하며 튜브 바닥에서 DNA 용액을 조심스럽게 피펫으로 옮기십시오.

다음 단계에서는 Promega Wizard DNA Cleanup 시스템을 사용합니다. DNA 샘플에 레진 1 mL를 첨가하고, 튜브를 뒤집어 혼합한 다음, 용액을 탈염 컬럼이 연결된 주사기에 피펫으로 옮깁니다. 마지막으로, 유리 비설파이트 이온을 제거하기 위해 비설파이트 처리된 DNA를 탈염 컬럼에 통과시키고 50 µL의 Milli Q water로 용리합니다.

다음 단계는 탈염을 통해 우라실 링에서 비설파이트 어틱을 제거하는 것입니다. 이를 위해, 각 비설파이트 처리된 DNA 샘플에 갓 조제한 3 M 수산화나트륨 5.5 µL를 첨가하여 최종 농도가 0.3 M이 되게 합니다. 그다음 샘플을 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.

샘플을 짧게 원심분리한 다음 각 샘플에 1 µL의 TRNA를 첨가하십시오. 아세트산 암모늄을 최종 농도가 3 M이 되도록 첨가하여 용액을 중화합니다. 다음으로 에탄올 침전법을 통해 DNA를 침전시킵니다.

얼음처럼 차가운 100% ethanol 330 µL를 첨가하고 도립 혼합하여 잘 섞어줍니다. -20 °C에서 1시간부터 하룻밤 동안 보관한 후, 4 °C에서 14,000 ×g로 15분간 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 모두 제거하고 침전된 DNA를 약 20분 동안 공기 건조합니다.

공기 건조 후에는 펠릿이 거의 보이지 않으므로, DNA 펠릿을 50 µL의 0.1 XTE 또는 물에 다시 현탁합니다. 이를 실온에서 약 2시간 동안 방치하며, 이 과정 동안 가끔 튜브를 볼텍싱하여 DNA가 완전히 용해되었는지 확인한 후 빠르게 원심분리합니다. DNA가 용해되면 DNA의 양과 품질에 따라 -20 °C에서 1~10년 동안 보관하거나 즉시 사용할 수 있습니다. PCR 증폭의 경우, 프라이머 최적화가 이 절차에서 가장 어려운 단계입니다.

따라서 프라이머 설계의 성공을 보장하기 위해 다음과 같은 가이드라인을 제공합니다. 이러한 가이드라인을 설명하기 위해 표적 서열을 아황산염으로 변환하였으며, 변환된 시토신은 파란색 T로, 변환되지 않은 CpG 사이트는 빨간색 cg로 표시하였습니다. 특이성을 보장하기 위해 프라이머의 길이는 24에서 30 base pair여야 합니다. 프라이머의 예상 Tm 값은 50 °C 이상으로 서로 비슷해야 하며, 그 차이가 1~2 °C를 초과하지 않아야 합니다.

전환 특이성을 보장하기 위해 프라이머는 약 25%의 C-to-T 염기를 포함해야 합니다. 전환된 D-N-A-C-P-G 디뉴클레오타이드의 증폭을 확실히 하기 위해 3' 말단의 마지막 염기는 C-to-T여야 합니다. 메틸화, 비메틸화 또는 미전환 템플릿에 대한 잠재적 편향을 방지하기 위해 프라이머 서열 내에 CpG 부위가 포함되는 것은 피해야 합니다. 하지만 불가피한 경우, 전환된 DNA의 편향 없는 증폭을 보장하기 위해 CpG 부위의 사이토신을 Y로 대체해야 합니다.

마지막으로, 필요한 경우 PCR 반응의 특이성 또는 민감도를 보장하기 위해 네스티드(nested) 또는 세미 네스티드(semi nested) 프라이머 세트를 설계하십시오. 최적화를 위해 PCR 증폭 반응 혼합물을 25 µL씩 분주하여 준비합니다. 각 반응에는 아황산염 처리된 genomic DNA, DPS 프라이머, magnesium chloride, potassium chloride, tris hydrochloride pH 8.3, polymerase를 포함하여 메틸화 또는 비메틸화 물질의 증폭 편향을 테스트합니다.

bisulfite 전환 후 비례적인 PCR 증폭을 테스트하기 위해 50:50 비율의 메틸화 및 비메틸화된 완전 bisulfite 전환 대조군 샘플을 사용하십시오. 특정 프라이머와 PCR 반응 혼합물을 사용하여, 프라이머의 TM으로부터 ±3 °C 범위의 온도 구배가 설정된 온도 구배 써모사이클러(temperature gradient thermocycler) 내 8~10개의 튜브에서 반응을 진행하십시오. 튜브를 보텍싱하고 마이크로 원심분리기로 짧게 스핀 다운한 후 써모사이클러에 넣으십시오. 이 그림은 50% 메틸화 및 비메틸화 DNA 혼합물로부터 얻은 온도 구배 PCR 증폭 프로파일의 아가로스 겔 결과를 보여줍니다.

T로 표시된 2, 5, 8번 레인의 PCR 증폭산물은 메틸화된 DNA만 절단하는 제한효소로 처리되었습니다. 최적의 PCR 증폭 조건에서는 메틸화된 증폭산물과 비메틸화된 증폭산물이 편향 없이 비율대로 증폭되어야 하며, 그 결과 여기서 보는 것과 같이 절단된 PCR 산물과 절단되지 않은 PCR 산물의 양이 동일하게 나타나야 합니다. 편향 없는 증폭을 위한 최적의 열 순환 조건은 55.6 °C입니다. 비설파이트 DNA의 완전한 전환 여부는 전환되지 않은 DNA만 절단하는 사이토신 부위 특이적 효소를 사용하여 3, 6, 9번 레인에서 분석할 수 있습니다.

여기서는 3번, 6번, 9번의 세 개 레인 모두에서 절단된 DNA가 관찰되지 않으므로 완전한 비설파이트 DNA 전환이 이루어졌음을 알 수 있습니다. 이 실시간 해리 곡선은 완전 메틸화된 DNA(분홍색 선, m)와 비메틸화된 DNA(초록색 선, U)가 각각 82.9 °C 및 86.9 °C에서 해리되는 대조군 증폭 결과와 비교했을 때, 메틸화 및 비메틸화 DNA가 동일한 비율로 혼합된 50:50 혼합물(빨강-주황색 선)을 보여줍니다. 이는 서로 다른 분자가 해리되는 온도에 따른 증폭 편향이 없음을 나타냅니다.

비설파이트 처리된 시료를 증폭하여 얻은 PCR 단편은 아가로스 겔 전기영동으로 시각화하고 서열 분석을 수행할 수 있습니다. 여기에 세 가지 서로 다른 세포주에서 얻은 서열 트레이스를 직접 제시하였으며, CpG 사이트는 노란색으로 강조 표시하였습니다. 세포주 X는 세 곳의 CpG 사이트 모두에서 100% 메틸화를 나타내는 반면, 세포주 Y와 Z는 여기에 표시된 중첩된 GA 신호를 통해 알 수 있듯이 다양한 정도의 메틸화를 보여줍니다. 그림 4A는 CpG 사이트가 노란색으로 강조된 세 가지 서로 다른 세포주의 서열 트레이스입니다.

개별 클론의 직접 시퀀싱 후, 개별 분자의 메틸화 상태를 비설파이트 맵(bisulfite map)으로 도표화할 수 있습니다. 메틸화의 이질성을 시각화하기 위해, 개별 CpG 사이트의 메틸화 밀도를 빨간색으로 표시하였습니다. 이 대표적인 비설파이트 맵은 샘플에 대한 고처리량 정량적 메틸화 분석 결과를 보여줍니다.

Sequenome epi typer 기술을 사용하면 그림 5 A에 나타난 예시와 같이 메틸화된 시토신의 존재 여부에 따른 특정 스펙트럼을 생성할 수 있습니다. 이후 샘플 내 비율의 요약본을 에피그램(epigram) 형태로 외삽할 수 있으며, 이는 그림 5 B에 제시되어 있습니다. 이 예시는 네 가지 서로 다른 세포주에 대해 각 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 백분율을 보여줍니다. 마지막으로, 에피그램이 생성된 후 이를 바탕으로 메틸화 플롯 요약(methylation plot summary) 그림 5 C를 도출할 수 있습니다. 이 기술은 후성유전학 분야의 연구자들이 DNA 메틸화와 이것이 인간 질병에서 하는 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.