JoVE 실험 백과사전
신경과학
0 조회수 • 3:33 분 • June 17th, 2025
1-7 체절 수준에서 신경관이 절제된 초기 단계 배아를 포함하는 창문이 있는 수정된 닭고기 달걀로 시작합니다.
단계가 일치하는 형질전환 닭 배아에서 GFP 표지 기증자 신경관을 채취하여 수혜자에게 이식하여 적절한 해부학적 방향을 보장합니다.
이식편 주변의 과도한 액체를 제거하여 기증자와 숙주 조직 사이의 접착력을 강화합니다.
탈수 및 오염을 방지하기 위해 투명 테이프로 창을 밀봉하십시오.
배아가 원하는 단계로 발달할 때까지 난자를 부화시킵니다.
테이프를 제거합니다.
배아를 향해 혈액을 운반하는 난황의 난란 정맥을 식별하고 위에 있는 난란막을 제거합니다.
유리 바늘을 사용하여 친유성 형광 염료를 정맥에 꾸준히 주입합니다.
입체 형광 현미경으로 배아를 시각화합니다.
주입된 염료는 혈관을 감싸고 있는 내피 세포에 결합하여 혈관망을 강조하고, GFP 표지된 신경관은 신경망 추적을 가능하게 합니다.
이식 절차를 시작할 준비가 되면 해부된 신경관을 시계 유리에서 숙주 배아로 조심스럽게 옮깁니다. 신경관을 올바른 방향으로 배치합니다. 그리고 인접한 외식편을 절제 부위로 부드럽게 밀어 넣습니다. 필요한 경우 마이크로 메스를 사용하여 절제 부위의 정확한 크기로 외식편을 다듬습니다.
올바른 위치에 있으면 PBS 및 기타 체액을 제거하여 기증자와 숙주 조직이 부착되고 이식편을 확립하는 데 도움이 됩니다. 이식된 GFP 양성 신경관을 야생형 닭 숙주에 성공적으로 통합하는 것은 형광 현미경으로 평가할 수 있습니다. 탈수 및 오염을 방지하기 위해 24mm 너비의 투명 테이프로 창 전체를 밀봉하십시오.
키메라 배아에 라벨을 붙입니다. 그리고 추가 발달을 위해 계란을 인큐베이터로 되돌립니다.
원하는 실험 시점에서 인큐베이터에서 난자를 회수합니다. 그리고 배아에 접근하기 위해 투명 테이프를 제거합니다. 보이면 난황에서 접근 가능한 정맥을 찾아 혈류가 배아 쪽으로 향하는지 확인합니다.
주입 위치에 대한 vitelline 정맥 중 하나의 분기점을 선택합니다. 핀셋을 사용하여 반대 방향으로 찢어 선택한 주입점 위의 vitelline 멤브레인을 제거합니다. 다음으로 당긴 유리 바늘의 직경을 정맥 크기에 맞게 조정합니다.
바늘에 5-10마이크로리터의 DiI 용액을 넣습니다. 바늘을 정맥에 신속하게 삽입합니다. 그리고 입관으로 꾸준히 불어 DiI가 혈전을 형성하지 않고 천천히 혈류에 합류할 수 있도록 합니다. DiI 주사의 성공 여부는 형광 현미경으로 배아를 잠깐 관찰하여 평가할 수 있습니다.