공초점 현미경을 사용한 마우스 신경 말단의 빠른 칼슘 과도 현상 이미징

공초점 현미경 아래에 위치한 고정된 마우스 근육이 포함된 실리콘 엘라스토머 코팅 실험 챔버로 시작합니다.

근육은 근육 수축을 차단하는 억제제가 포함된 생리학적 용액에 담급니다.

형광 칼슘 염료로 표지된 신경 그루터기는 전기 자극기에 연결된 흡입 전극 내부에 위치합니다.

신경근 접합부에서 말초 신경은 근육과 연결되어 있습니다.

전극을 사용하여 신경에 전기 자극을 가합니다. 이것은 세포내 칼슘 염료에 결합하는 칼슘 이온의 급속한 유입을 유발합니다.

신경근 접합부를 비추어 칼슘 염료를 자극하여 형광을 발하게 합니다.

그런 다음 고해상도 이미지를 캡처하여 말초 신경 말단의 빠른 칼슘 과도 현상을 기록합니다.

관심 영역을 선택하고 형광 강도를 측정합니다.

형광 강도의 급격한 증가는 말초 신경 말단에서 칼슘 유입을 나타내고 감소는 칼슘 청소율을 반영합니다.

10마이크로몰 D-투보쿠라린이 함유된 링거 용액으로 관류 시스템을 채우고 관류 흡입 펌프를 켜서 관류를 시작합니다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 LSCM 소프트웨어에서 전기생리학 및 획득 모드를 선택하여 이미징 매개변수를 설정합니다. 작업 메뉴 설정에서 트리거 설정을 선택하여 현미경 동기화 펄스로 자극기를 트리거하고 프레임 필드에서 트리거 출력을 OUT 1 채널로 설정합니다.

스캔 모드를 1,400Hz의 스캔 주파수에서 xyt로 돌립니다. 확대/축소 계수는 핀홀이 완전히 열린 상태에서 6.1이어야 합니다. 순차 트랜스패스 양방향 x 모드가 켜져 있는지 확인합니다. 그런 다음 프레임을 형성하는 최소 시간을 52밀리초로 설정하고 원시 비디오의 프레임을 20프레임으로 수집합니다. 아르곤 레이저의 여기 파장을 출력 전력의 8%로 488나노미터로 설정합니다.

매개변수가 설정되면 라이브 모드 버튼을 눌러 염료가 로드된 신경 말단의 실시간 미리보기를 얻을 수 있습니다. 라이브 모드에서 관심 영역(ROI)을 검색하여 최상의 초점을 얻은 다음 자극기의 지연을 이전 값에 비해 2밀리초 적게 이동합니다. 그리고 데이터 수집 소프트웨어를 실행하여 각 시퀀스를 이전 시퀀스에서 2밀리초 이동하여 26개의 시퀀스를 수집합니다.