바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포의 Patterning
2007년 10월 1일
우리는 기판에 원하는 장소에서 세포를 삽입하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. 이 방법은 패턴을 기판에 전지 가득 microwells를 포함하는 실리콘 칩을 틀지하여 세포를. 이 방법은 세포 사이의 diffusible 및 juxtacrine 신호를 조절하는 새로운 방법을 제공합니다.
저는 Bowman 실험실의 대학원생인 nickel Mital입니다. 오늘은 저희 실험실의 이전 학생 두 명이 개발한 bio flip chip이라는 장치에 대해 말씀드리겠습니다.
이 장치를 통해 실험자가 선택한 기판 위에 원하는 구성으로 세포를 전달할 수 있습니다. 여기 준비된 장치에서 볼 수 있듯이, 장치 자체는 매우 단순합니다. 기본적으로 실리콘 조각에 작은 웰(well)들이 형성되어 있는 구조입니다.
각 웰은 보통 단일 세포 하나만 수용하도록 설계되지만, 필요한 경우 당연히 크기를 더 크게 만들 수 있습니다. 장치는 세포가 최종적으로 기판 위에 배치될 배열과 동일하게 웰이 구성되도록 제작됩니다. 따라서 장치 자체는 소프트 리소그래피(soft lithography) 공정을 통해 제작됩니다.
구체적으로, 우리는 폴리디메틸실록산인 PDMS를 사용하며, 이를 실리콘 웨이퍼로 몰딩합니다. 여기에 해당 샘플이 있습니다. 몰드 웨이퍼 자체는 실리콘 웨이퍼 위에 스핀 코팅한 SU-8 포토레지스트를 패턴화하는 표준 포토리소그래피 공정을 통해 제작됩니다.
요약하자면, 바이오 플립 칩의 웰을 세포로 채워 선택한 기판 위로 세포를 전이시킵니다. 그런 다음, 주로 폴리스티렌 조직 배양 기판인 선택한 기판에 칩을 부착합니다. 마지막으로, 결합체를 뒤집어 세포가 웰에서 나와 기판 위로 떨어지게 합니다.
안녕하세요, Stephanie Flavin입니다. 저는 Goldman 연구실의 학부 연구원이며, 오늘은 패턴 형성 실험 전날 바이오 플립 칩(bio flip chip)을 사용하여 세포 패턴을 만드는 방법을 시연하겠습니다.
PDMS를 1인치 x 1인치 유리 슬라이드에 플라즈마 본딩합니다. 그런 다음 칩의 웰 쪽이 아래로 향하게 하여 PBS 용액에 하룻밤 동안 담가둡니다. 또한 패터닝 실험에 사용할 가스켓을 절단하고, 함께 사용할 바인더 클립을 준비합니다.
각 칩의 표면에 200 µL의 BSA를 도포합니다. 피펫 팁으로 칩 표면을 가볍게 흔들어 기포를 제거하고 BSA 용액이 웰을 채우도록 합니다. 칩을 후드 아래에 두고 일반적인 UV 광 통과 세포 처리 방식과 동일하게 한 시간 동안 방치합니다.
1시간 후 칩에서 BSA 용액을 흡입하여 제거하고, 각 칩을 200 µL의 PBS로 세척합니다. 10⁶ cells/mL 밀도의 세포 부유액 200 µL를 분주합니다. 세포가 웰 내부로 가라앉을 때까지 5~10분 동안 기다린 후, 칩 표면을 PBS로 헹굽니다. 칩을 약 15도 각도로 한쪽 구석으로 기울인 다음, 칩의 바닥 모서리에서 세포 용액을 천천히 피펫으로 제거합니다.
칩을 수평으로 유지한 상태에서 PBS 50 µL를 상단 모서리에 천천히 첨가합니다. 세척 단계를 필요한 횟수만큼 반복합니다. 칩 표면에서 xls가 모두 세척되면, 디쉬의 내부 가스켓에 배지를 약 50 µL 첨가합니다.
각 칩의 상단에 배지를 추가합니다. 그다음, 디쉬를 뒤집어 한쪽 모서리부터 시작하여 칩 표면 위로 기울이며 내립니다. 이어서 디쉬와 칩 사이에 기포가 형성되지 않도록 디쉬를 칩 위에 밀착시켜 평평하게 놓습니다.
칩의 양측면에 바인더 클립을 추가하여 칩을 고정합니다. 칩을 뒤집었을 때 디쉬 위에 수평으로 놓일 수 있도록 각 바인더 클립에서 손잡이를 제거하십시오. 칩을 인큐베이터로 옮긴 후, 불필요한 움직임을 모두 최소화하며 빠르게 뒤집습니다.
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개요
본 연구는 바이오 플립 칩(bio flip chip)이라 불리는 장치를 사용하여 기판 위에 세포를 배치하는 새로운 방법을 제시합니다. 세포가 채워진 마이크로웰이 있는 실리콘 칩을 기판 위로 뒤집어 올림으로써, 연구자들은 세포 배치를 효과적으로 제어하고 세포 간 신호 전달의 조절 능력을 향상시킬 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 신경 과학
- 생체 공학
배경
- 세포 상호작용 연구에서는 세포 배치가 매우 중요합니다.
- 기존 방법들은 세포 배치 정밀도가 부족할 수 있습니다.
- 바이오 플립 칩(bio flip chip)은 간단하고 효과적인 해결책을 제공합니다.
- 이 기술은 확산성 신호 전달과 병치 신호 전달(juxtacrine signaling) 모두에 영향을 줄 수 있습니다.
연구 목적
- 기판 위에 세포를 배치하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- 세포 신호 전달 메커니즘에 대한 이해를 높입니다.
- 다양한 생물학 분야의 연구자들에게 유용한 도구를 제공합니다.
사용된 방법
- 바이오 플립 칩의 설계 및 제작.
- 마이크로웰에 세포 충전.
- 칩을 원하는 기판 위로 뒤집기.
- 세포 배치 및 신호 전달 관찰 및 분석.
주요 결과
- 표적 위치에 세포를 성공적으로 배치함.
- 세포 신호 전달 조절 능력의 향상.
- 장치의 사용 편의성 입증.
- 다양한 실험 설정에서의 잠재적 응용 가능성.
결론
- 바이오 플립 칩은 세포 배치를 위한 혁신적인 도구입니다.
- 이 방법은 세포 신호 전달 연구에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.
- 향후 연구에서는 더 광범위한 응용을 위해 이 기술을 확장할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
세포 집단의 정밀한 공간적 제어는 줄기세포 기반 질환 모델의 타겟 검증에 필수적인 확산성 및 인접분비 신호 전달 경로의 기전적 분석을 가능하게 합니다. Bio Flip Chip은 기질에 구애받지 않고 화학적 성질을 보존하며 정의된 세포 미세환경을 패턴화할 수 있는 방법을 제공하여, 표현형 스크리닝을 위한 재현성 있는 분석법 개발을 지원합니다. 이러한 접근 방식은 세포 간 접촉 및 파라크린 인자 노출의 가변성을 줄임으로써 초기 발견 단계에서의 예측 신뢰도를 높이며, 결과적으로 인비트로 모델에서 전임상 검증으로 이어지는 중개 연속성을 향상시킵니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 국소적인 세포 밀도와 공간적 배치가 줄기세포 분화 및 자가 재생 경로에 미치는 영향에 대한 가설 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 무작위 시딩(seeding)으로 인한 확률적 변동성을 제거하여, 반복 실험 전반에 걸쳐 일관된 인접 분비(juxtacrine) 및 파라크라인(paracrine) 신호 입력값을 보장합니다.
- 예측적 가치: 표적 결합 연구에서 접촉 의존적 신호 전달과 수용성 신호 전달의 기여도를 분리함으로써 기전적 리스크 감소(de-risking)를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 고함량 이미징 및 다중 판독(multiplexed readouts)과 호환되는, 정량 가능하고 공간적으로 정의된 세포 어레이를 생성합니다.
- 운용적 가치: 기질의 화학적 성질을 변경하지 않고도 조직 배양용 폴리스티렌, 유리, Matrigel 및 피더 층(feeder layers) 전반에 걸쳐 세포 간 상호작용 분석의 표준화를 가능하게 합니다.
- 확장성: 마이크로컨택 프린팅(microcontact printing)과 호환되어 세포외 기질 패턴을 생성할 수 있으며, 이를 통해 접착 및 신호 전달 단서의 조합 제어가 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성: 정의된 니치(niche) 내에 배아줄기세포를 패턴화하여 선천성 질환 및 재생 의학과 관련된 발생 신호 전달 경로를 모델링합니다.
- 전임상 모델링: 공간적으로 제어된 미세환경에서 형태 형성 인자 또는 치료제의 용량-반응 분석을 용이하게 하여 생리학적 관련성을 향상시킵니다.
- 리스크 조정 진전: 제어되지 않은 세포 응집이나 가변적인 접촉 빈도로 인한 노이즈를 최소화함으로써 리드 화합물 발굴 시의 위양성을 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
Bio Flip Chip은 화합물 노출 전 줄기세포의 재현 가능한 패턴 형성을 가능하게 하여 초기 발굴 워크플로우에 통합되며, 이를 통해 리드 최적화 단계에서의 가설 기반 스크리닝 및 기전 추적 연구를 지원합니다.
- 발견 생물학: 배아 줄기세포의 정의된 공간적 조직화가 계통 분화 및 경로 활성을 어떻게 조절하는지 테스트합니다.
- 스크리닝: 접촉 의존성 및 확산성 신호 전달에 대한 화합물의 효과를 평가하기 위해 표준화되고 재현 가능한 세포 기질을 제공합니다.
- 분석: 패턴화된 공배양에서 종속 변수로서 마커 발현, 증식 및 세포 사멸의 정량적 공간 매핑을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 공간적으로 제어된 시스템에서 인간 발달 신호 전달 폭포(signaling cascades)를 모델링하여 전임상 표적 선정에 정보를 제공합니다.
- 기업적 재사용: 프로젝트 전반에 걸쳐 여러 세포 유형, 기질 및 세포외 기질 구성에 맞게 조정 가능한 모듈형 패턴화 플랫폼으로 기능합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 제어되지 않은 세포 간 상호작용으로 인한 생물학적 노이즈를 감소시켜 타겟 검증의 신뢰도를 높입니다.
- 운용적 가치: 시딩 기법의 가변성과 무관하게 사용자가 정의한 정밀한 세포 배치를 통해 분석의 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 세포 간 통신을 타겟으로 하는 표현형 스크리닝에서 신호 대 잡음비를 향상시켜 go/no-go 결정 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 줄기세포 매개 질환 분야에서 juxtacrine 경로(예: Notch, Wnt) 조절제의 위험 조정 우선순위 결정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 칩 제작 또는 조달을 위해 소프트 리소그래피 및 PDMS 취급에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 기판 준비를 위한 플라스마 본딩 장비 및 UV/오존 처리 장비의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 효율적인 웰 로딩 및 방출을 보장하기 위해 표준화된 세포 준비 및 세척 프로토콜이 필요합니다.
- 3D 매트릭스 또는 미세유체 시스템에 적용할 경우, 플립 타이밍과 표면 에너지의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실질적 제한 사항: 단일 세포용으로 설계된 웰에 여러 세포가 로딩되는 것을 방지하기 위해, 각 세포 유형 및 크기에 따른 웰 점유율을 경험적으로 결정해야 합니다.
