Name: 바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포의 Patterning (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:21:11.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 배우세요 바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포를 정밀하게 배치하는 방법을. 이 기술은 세포 신호 전달 연구와 세포 생물학 실험에서 정확한 세포 패턴 형성을 가능하게 합니다.

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이 작품은 NIH 부여 EB007278에 의해 지원되었다.

BFC 만들기 BFCs는 4 &quot;시 마스터 웨이퍼를 통해 성형 polydimethylsiloxane (PDMS)에 의해 만들어집니다. 마스터 웨이퍼 만들기 <ol><li> 130 30 분시의 웨이퍼를 dehydrating부터 시작 ° C. </li><li> 스핀 - coater에서 웨이퍼를 놓고, 각각 40~30밀리미터의 기능을 높이를 얻을 수 30 s에 대한 3000-4000 RPM 300 RPM / s에서 램프, 웨이퍼에 SU8 - 2050 (Microchem)을 붓고, 그리고 스핀. </li><li> 스피닝 후 65 ° C 열판에 웨이퍼를 장소, 즉시 ° C 5-6 분, 그리고 65 ° C. 그것을 아래 진입로 95 온도를 램프 </li><li> 어두운 필드 마스크를 사용하여 연락처 aligner 200 MJ / cm 2의 UV 복용에 웨이퍼를 노출. </li><li> 65 ° C 열판에 웨이퍼를 놓고 즉시 95의 온도를 램프 ° 후 4-5 분 C 및 65 ° C. 그것을 아래로 램프 </li><li> PM 아세테이트 및 이소프로판올의 웨이퍼를 개발할 수 있습니다. </li><li> 헥사 메틸 디 실록산을 (신 Etsu MicroSi)를 사용하여 30 분 웨이퍼를 Silanize, 또는 (Tridecafluoro - 1 ,1,2,2 - tetrahydrooctyl) - 1 - trichlorosilane에서 PDMS를 방지하기 위해 (t2492 - KG, UCT Specialities, 브리스톨, PA) 시 마스터 웨이퍼에 준수. </li></ol> 성형 칩 <ol><li> 10시 1분 비율 혼합 PDMS은 (다우 코닝, Sylgard 184), 마스터시 웨이퍼 (웨이퍼 당 ~ 15g)을 통해 그것을 부어,하고 실온에서 하룻밤 치료하자. </li><li> 필시 웨이퍼에서 PDMS를 치료하고 면도날을 사용하여 각 칩을 잘라 버릴거야. </li><li> 쉽게 처리할 수있는 1x1 cm 컷 현미경 슬라이드에 본드 각 칩을. </li></ol> 사용 BFC 준비 <ol><li> 실험 중에 PDMS에 미디어의 흡수를 방지하기 위해 PBS에 BFC 하루를 만끽해보세요. </li><li> Kimwipe (Kimtech 과학)로 칩을 건조. </li><li> 7.5 %의 감소를 넣어 소 혈청 알부민 (BSA) (~ 200 ML) BSA를 분산하고 우물에서 모든 거품을 제거하는 피펫 팁 그것을 긁어 다음 BFC의 패턴 표면에합니다. </li><li> 적어도 0.5 시간 동안 BFC 표면에 BSA를 남겨주세요. 이상적으로 BSA에게 crusting 방지하기 위해 매 15 분 선동. </li><li> 35x10 mm TCPS 요리 내부 BFC (팔콘, 35-3001)를 맞추려면, 아래 있도록 TCPS 요리 절반 방식의 테두리를 잘라 그 어 &quot;바인더 클립 (오피스 디포)는 칩 클램프하기 위해 접시 가장자리를 통해 들어갈 것이고, 함께 요리. </li><li> PDMS 시트에서 스페이서 가스켓 (20&#39;20 mm 바깥 가장자리, 15&#39;15 mm 안쪽 가장자리와 2백50~5백밀리미터 두께와 프레임 형태) (실리콘 특수 제품) 또는 다른 실리콘을 잘라, 그리고 요리에 적용 핀셋을 사용합니다. </li></ol> BFC로 Patterning 세포 <ol><li> 1 분 자외선 아래 접시, 가스켓, BSA - 코팅 칩, 2 바인더 클립을 소독. </li><li> BSA를 대기음 200 ML PBS로 두 번 BFC를 씻어. </li><li> 휴대폰 라인에 필요한 경우 컷 TCPS 요리에 젤라틴 추가합니다. 그렇지 않으면, 칩 (아래 참조)에 적용하기 전에 일부 매체와 TCPS 표면을 젖었어. 이것은 챔버의 형성에서 거품을 방지합니다. </li><li> PBS를 aspirating 후, 세포 솔루션 피펫 200 ML (~ 1 × 10 6 세포 / ML) BFC 표면. 세포 5-10 분 정착하자. </li><li> ~ 15 ° 각도로 한 구석에 BFC를 기울이기 천천히 200 ML의 피펫으로 세포 솔루션을 피펫. 그런 다음, BFC 평면을 배치하고 반대 BFC 코너에 PBS 또는 빈 미디어의 100 ML를 추가합니다. 상호 물론 지역의 모든 세포를 취소하고,이 방식으로 필요한 추가 2-4 번, BFC를 씻어. </li><li> 칩 표면에 미디어의 피펫 200 ML. TCPS에서 젤라틴 / 미디어 대기음. 그런 다음 미리 침수 요리를 반전 천천히 그릇에, BFC의 최대 밀어. </li><li> 바인더 그것을 봉인하기 위해 챔버의 양측에 각각 클립 적용합니다. 이상의 이성을 상실 때 요리는 레벨 남아 있도록 바인더 클립에서 금속 접지 단자를 제거합니다. </li><li> 마지막으로, 신속하게 불필요한 움직임을 피하는 동안에 걸쳐 설치를 플립, 그리고 보육에 놓으십시오. </li></ol>

<ol><li>Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Patterning+Chip+for+Controlling+the+Stem+Cell+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment.</a> Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).</li>
</ol>

여기에 나와있는 프로토콜 및 비디오 패턴 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에 BFC 1을 사용 설명하지만, BFCs는 패턴의 관심 실질적으로 모든 세포 유형을 사용할 수 있습니다. 하나는해야 수있는 유일한 변화는 microwells의 크기를 변경하는 것입니다. 우리의 경험에서 가장 잘 작동 다른 세포 유형, microwell 직경과 무소속의 세포 직경보다 10 미크론와 같은 높이의 패턴을 하나의 세포로 BFC를 사용할 수 있습니다. BFCs는 프로토콜의 중요한 변경없이 다른 세포를 포함한 다른 기판, 패턴에 세포에도 사용할 수 있습니다. 기존 셀 계층에 Patterning는 mESCs 인간 ESCs 포함한 특정 celltypes는, 지원이나 피더 세포 문화에서 적절한 표현형을 유지하기 위해 수행해야하기 때문에 기존의 세포 patterning 접근 방식을 통해 BFC 접근법의 장점입니다. 우리가 추구하는 BFC 중 하나는 응용 프로그램은 마우스 배아 줄기 세포 사이에 신호 조사 BFC를 사용하는 것입니다. 다른 그...

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 마스터 몰드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>Falcon BD</td><td>35-3001</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>3/4&quot; 바인더 클립</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>헥사메틸디실록산</td><td>Shin-Etsu MicroSi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>신규 항목</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU8-2050</td><td></td></tr><tr><td>PM 아세테이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>7.5% 소 혈청 알부민</td></tr></tbody></table>

바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포의 patterning

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

diffusible 신호와 세포 세포 접촉 (juxtacrine 신호)의 구성 세포 - 세포 상호 작용은 종양 성장, 줄기 세포 분화와 줄기 세포 자체 재생과 같은 다양한 생물 학적 과정에 중요합니다. 방법 숫자는 현재 체외에서 세포 신호를 변조하기 위해 존재합니다. diffusible 신호의 modulating 총액의 한 가지 방법은 문화 중에 세포 시딩 밀도를 변경할 수 있습니다. 셀 심는 실제 셀 - 셀 간격 및 셀 셀 문의 금액에 상당한 차이이 결과와 지역 환경을 처방할 수의 무작위 특성으로 인해. modulating 세포 신호에 대한보다 구체적인 접근 방식은 특정 신호 단백질을 노크 분자 억제제 또는 유전자 접근 방법을 사용하는 것입니다하지만, 이러한 방법 모두는 최고의 분자 작은 숫자를 조작하는 데 적합합니다. 여기, 우리는 기판에 원하는 장소에서 세포의 서로 다른 숫자를 배치하여 세포의 클러스터의 로컬 환경을 modulates modulating 세포 세포 신호 전달에 대한 새로운 접근 방식을 보여줍니다. 이 방법은 세포 사이의 지역 diffusible 및 juxtacrine 신호를 제어하는​​ 보완적인 방법을 제공합니다. 우리의 방법은 바이오 플립 칩 (BFC)의 사용, 단일 셀 또는 셀 작은 숫자 중 하나를 잡아 microwells, 각 크기의 수백 - 투 - 수천을 포함하는 microfabricated 실리콘 칩을 수 있습니다. 우리는 단순히 우물의 배열에 그들을 pipetting하고 배열에서 내렸어요 세포를 세척하여 세포와 칩로드합니다. 세포들이 patterning을 유지, 우물과 기판에 빠질 의하여이 칩은 다음, 기판에 뒤집혀 있습니다. 세포가 첨부되면 칩 (또는 왼쪽) 제거할 수 있습니다. 세포 patterning이 방법은 독특한 것을에 : 1) 따라서 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식하고 마이 그 레이션 수 있도록 기판의 화학을 변경하지 않고 조직 문화 폴리스티렌, 유리, matrigel 포함한 모든 기판에 patterning이 가능 2), 그리고 심지어 피더 세포 레이어를하며, 3) 그 제도 안에 세포와 세포외 기질 제도의 창조를 허용 전통 microcontact 인쇄와 호환됩니다. 이 비디오에서는, 우리는 BFC를 사용하여 조직 문화의 폴리스티렌에 마우스 배아 줄기 세포의 patterning을 보여줍니다.

우리는 기판에 원하는 장소에서 세포를 삽입하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. 이 방법은 패턴을 기판에 전지 가득 microwells를 포함하는 실리콘 칩을 틀지하여 세포를. 이 방법은 세포 사이의 diffusible 및 juxtacrine 신호를 조절하는 새로운 방법을 제공합니다.

바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포의 Patterning

확산성 신호 전달과 세포-세포 접촉(병치 분비 신호 전달)으로 구성되는 세포 간 상호작용은 다음과 같은 수많은 생물학적 과정에서 중요합니다...

안녕하세요, Nickel Mital입니다. 저는 Bowman 연구실의 대학원생입니다. 오늘은 저희 연구실의 이전 학생 두 명이 개발한 Bio Flip Chip이라는 장치에 대해 말씀드리겠습니다.또한 이 장치는 실험자가 선택한 기질 위에 원하는 구성으로 세포를 전달할 수 있게 해줍니다. 따라서 여기 준비된 것과 같이 장치 자체는 매우 단순하며, 기본적으로 실리콘 조각에 작은 웰들이 구성되어 있습니다.각 웰은 보통 단일 세포 하나만 수용하도록 설계되지만, 필요한 경우 당연히 더 크게 제작할 수 있습니다. 장치는 세포가 최종적으로 기판 위에 배치될 배열과 동일하게 웰이 구성되도록 제작됩니다. 따라서 장치 자체는 소프트 리소그래피(soft lithography) 기법을 사용하여 제작됩니다.특히, 본 실험에서는 폴리디메틸실록산인 PDMS를 사용하며, 이를 실리콘 웨이퍼를 이용해 성형합니다. 여기 그 샘플이 있습니다. 몰드 웨이퍼 자체는 실리콘 웨이퍼 위에 스핀 코팅한 SU-8 포토레지스트를 표준 포토리소그래피 공정으로 패턴화하여 제작합니다.요약하자면, 기본적으로 바이오 플립 칩의 웰을 세포로 채움으로써 선택한 기질로 세포를 전이시킵니다. 그런 다음 이 칩을 주로 폴리스티렌 조직 배양 기질 위에 배치합니다. 마지막으로, 이 결합체를 뒤집어 세포가 웰에서 나와 기질 위로 떨어지게 합니다.저는 Stephanie Flavin입니다. 저는 이곳 Goldman 연구실의 학부 연구원이며, 오늘은 패턴 형성 실험 전날 바이오 플립 칩(bio flip chip)을 사용하여 세포를 패턴화하는 방법을 시연하겠습니다.PDMS를 1인치 x 1인치 유리 슬라이드에 플라스마 본딩합니다. 그 후 칩의 웰(well) 부분이 아래로 향하게 하여 PBS 용액에 담가 하룻밤 동안 둡니다. 또한, 패턴 형성 실험에 사용할 가스켓을 절단하고 함께 사용할 바인더 클립을 준비합니다.각 칩 표면에 200 µL의 BSA를 도포합니다. 파이펫 팁으로 칩 표면을 가볍게 흔들어 기포를 제거하고 BSA 용액이 웰을 채우도록 합니다. 칩을 후드 아래에 두고 평소와 같이 UV 광선이 투과되는 상태로 1시간 동안 방치합니다.1시간 후 칩에서 BSA 용액을 흡입하여 제거하고, 각 칩을 200 µL의 PBS로 세척합니다. 10⁶ cells/mL 밀도의 세포 현탁액 200 µL를 가합니다. 세포가 웰 내부로 가라앉을 때까지 5~10분간 대기한 후, 칩 표면을 PBS로 헹굽니다. 칩을 한쪽 모서리로 약 15도 각도로 기울인 다음, 칩의 하단 모서리에서 세포 용액을 천천히 피펫으로 제거합니다.칩을 수평으로 되돌리고 PBS 50 µL를 상단 모서리에 천천히 첨가합니다. 세척 단계를 필요한 만큼 반복하십시오. 칩 표면에서 xls가 모두 세척되면, 디시의 내부 가스켓에 약 50 µL의 배지를 첨가합니다.각 칩의 상단에 배지를 추가합니다. 그다음, 디쉬를 뒤집어 한쪽 모서리부터 시작하여 칩 표면에 기울여 내립니다. 이후 디쉬와 칩 사이에 기포가 형성되지 않도록 디쉬를 칩 위에 평평하게 밀착시킵니다.칩의 양측면에 바인더 클립을 끼워 단단히 고정합니다. 칩을 뒤집었을 때 접시 위에 수평으로 놓일 수 있도록 각 바인더 클립에서 손잡이를 제거하십시오. 칩을 인큐베이터로 옮긴 후, 불필요한 움직임을 모두 피하며 빠르게 뒤집습니다.

patterning-of-embryonic-stem-cells-using-the-bio-flip-chip

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포 생물학을위한 미세 규모 공학

우리는 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 배아 줄기 (ES) 세포에서 염색질 단백질 역학을 모니터 (플립) Photobleaching에서 형광 손실을 포함하여 photobleaching 방법을 설명합니다. 염색질 소성을 연구하는 방법 중 하나가 될 것으로 간주됩니다 염색질 단백질 역학은, pluripotent 세포 향상됩니다.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 차별화 별개의 조직 패턴으로 자기 조직하는 고유 능력을 가지고; 이 공간 환경 그라데이션의 표현을 필요로하지만. 우리 hPSC 분화 패턴을 제어하기위한 생화학 적 및 기계적 그라디언트를 생성하는 간단하고 강력한 방법으로서 공판 미세 패턴을 제시한다.

차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

여기에 제시된 방법은 포유류 문화 내에서 공간 조직을 드러내기 위하여 양적 화상 진찰과 함께 마이크로 패터닝을 이용합니다. 이 기술은 표준 세포 생물학 실험실에서 확립하기 쉽고 시험관 내에서 패터닝을 연구할 수있는 견인 시스템을 제공합니다.

마이크로패턴과 정량적 이미징을 사용하여 포유류 세포의 응급 공간 조직 매핑

세포외 매트릭스 리간드는 폴리아크릴아미드 하이드로겔에 패턴화되어 밀폐된 콜로니에서 인간 배아 줄기 세포의 배양을 준수기판에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 견인력 현미경 검사법 및 생화학 적 분석을 결합하여 조직 기하학, 세포 생성 힘 및 운명 사양 간의 상호 작용을 검사 할 수 있습니다.

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

이 논문은 다른 병리를 나타내는 다양한 모양의 심장 심근세포를 성장시키고 단일 세포 수준에서 자신의 형태에 따라 이러한 부착 된 심장 심근세포를 분류하는 방법을 제시합니다. 제안 된 플랫폼은 심부전의 다른 모형을 위한 높은 처리량 및 약 검열에 새로운 접근을 제공합니다.

단일 세포 수준에서 모양 의존적 전사학을 연구하는 접근법

여기서 우리는 DNA 프로그래밍 된 접착력을 사용하여 단일 세포 해상도에서 마이크로 패턴 세포에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 벤치탑 포토리소그래피 플랫폼을 사용하여 유리 슬라이드에 DNA 올리고뉴클레오티드 패턴을 만든 다음 상업적으로 사용할 수 있는 보완적인 올리고뉴클레오티드로 세포막을 라벨로 표시합니다. 올리고스의 혼성화는 프로그램된 세포 접착을초래한다.

DNA를 사용하여 세포의 간단하고, 적당한, 모듈식 패터닝

배우세요 바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포를 정밀하게 배치하는 방법을. 이 기술은 세포 신호 전달 연구와 세포 생물학 실험에서 정확한 세포 패턴 형성을 가능하게 합니다.

바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포의 Patterning

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