Name: 잘라내기 -로드 : 망막 뉴런 사이 간격 접합 추적 커플링의 범위를 검토를위한 유용한 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 학습하세요 망막 뉴런 간 간극 접합 추적 결합 범위를 조명 조건에서 평가하는 컷 로딩 기법을. 이 방법은 작은 세포체를 가진 뉴런 연구에 유용하며 신경 세포 간 통신 메커니즘 이해에 기여합니다.

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이 작품은 심폐소생술에 SCM과 EY018640에 NIH 부여 EY005102에 의해 투자되었다

1. 금붕어, 쥐 및 토끼에 대한 완전한 신경 망막의 준비 <ol><li> 상수 주변 (배경) 조명 아래에서 설명을 포함하여 다음 단계의 모든 "2) 컷 로딩"을 수행합니다. 이 프로토콜의 목적, 절차 (즉, 매우 어두운 (예 : "scotopic") 조건 하에서 ≤ 0.0001 룩스)를 야간 적외선 고글을 사용하여 지속적인 어둠에서와 같이 수행 설명되어 있지만, 끊임없이 주변 조명의 다른 높은 농도 수준 점에 유의하십시오 간격 접합 추적 커플링에 주변 조명의 다른 수준의 효과를 결정하는 대신 사용할 수 있습니다. </li><li> 어두운 적응 수술하기 전에 적어도 1 시간에 대한 실험 동물 (금붕어, 마우스 또는 토끼). </li><li> 마찬가지로 이전에 7 설명한 깊이 tricaine methanesulfonate (MS222, (나트륨 중탄산염 함유) 버퍼된 수조 물 150 MG / L)에서 그들을 배치하여 금붕어를 마취하고, 깊이 케타민을 (100 MG와 마우스를 마취/ kg, IP)와 rompun (10 MG / kg, IP). 깊이 우레탄과 토끼를 (선량로드 : 2.0 g / kg, IP)을 마취 또한 지역 intraorbital 마취 (2 % Xylocaine)를 사용하는 등 이전에 8 설명했다. 동물의 관리 및 사용과 관련된 모든 실험 절차는 연방 지침에 따라 수행되어야하며 지방 대학 동물 관리 및 사용위원회의 검토와 승인을 수 있습니다. (참고 :. 실험이 여기에 설명된에서 물고기의 보호 및 사용에 관련된 모든 실험 절차, 마우스 및 토끼는 NIH의 지침에 따라 수행되었으며 검토되었으며 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인) </li><li> 생선, 마우스 및 토끼 들어, 핵의 제거 다음, 각 안구의 앞쪽에 부분을 제거합니다. 그런 다음, 필터 종이 눈의 후부 부분 아래가되도록, 눈의 뒷부분 부분 위에 필터 종이를 놓고 필터 종이와 눈을 반전. 그렇다면, 괜찮아요 사용포셉 부드럽게 필터 종이에 붙어있는 신경 망막에서 서로에 연결된 안료 상피 / 맥락막 / 공막엔를 물러나고하여 안구의 후부 부분에서 신경 망막 손상을 해부하다. 이것이 완료되면서, 고급 용수철 가위를 사용하여 시신경을 절단. 신경 망막, 중심 photoreceptor 쪽까지가 현재 필터 종이에 붙어 눈의 나머지 부분에서 분리해야합니다. </li></ol> 2. 잘라내기 - 로딩 <ol><li> 과 일정한 주위 (배경) 조명 (아주 어두운 (예 : "scotopic") 조건 등)에 따라 30 분 6 잘 플레이트 (~ 5 ML / 음)의 여부에 상관없이 산소 울리는의 솔루션 (표 1) 잠수함은 망막 테스트 약물. parafilm으로 6 잘 판을 밀봉하여 산소의 물고기 망막 (5 % CO 2 / 95% O 2) 중탄산염 기반 울리는가 22의 ° C를 유지하고 5 %의 CO에서 36 ° C에서 마우스와 토끼 망막을 유지 2 / 95% O <li> 즉시 망막을 통해 절단하기 전에 울리는의 솔루션에 neurobiotin (0.5 %), biotinylated 분자를 해소하여 추적 솔루션 (일반적으로 100 μL)를 준비합니다. 0.5 %가 rhodamine dextran가 (높은 (&gt; 10,000) MW) 솔루션에 추가할 수 수 있습니다. 높은 분자량으로 인해, rhodamine dextran은 간격 분기점 및 절단에 의해 손상된 경우에만 레이블 세포를 건너하지 않습니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 3 이것은 그들이 부상 되었기 때문에 간격 분기점을 통해 확산하여 추적기 축적된 것을 사람에서 neurobiotin 축적이 세포를 구별할 수있는 유용한 방법입니다. </li><li> 유리 (또는 플라스틱) 페트리 접시에 neurobiotin 솔루션을 장소, 초과 벨소리를 제거 neurobiotin 솔루션의 면도날 (또는 다른 날카로운 블레이드) 수영 및 종이 타월에있는 망막이 첨부된입니다 필터 종이, 탭N 망막 및 필터 종이를 통해 방사형 몫을합니다. 원하는 경우, 스페이서는 컷이 망막을 통해 만들어진,하지만 필터 종이되도록 사용할 수 있습니다. 상처는 망막 표면에 수직 방향으로해야합니다. 다시 neurobiotin 솔루션에 면도날을 찍어 및 망막에게 두 번째 시간을 했네요. 망막마다 네 상처 (그림을 참조하십시오. 1)이 최대를 반복합니다. 마우스 및 기타 소형 망막을 통해 면도기 인하시 해부 현미경을 사용합니다. </li><li> 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 잘 6 판 (5 ML 벨소리 / 음)를 사용 또는 테스트 약물없이 1, 잠수함 신선한 벨소리의 중간에 다시 망막,. 로딩 및 확산 수 있도록 15 분에 대한 망막를 품어. </li><li> 5 분마다 신선한 울리는의 매체 또는 테스트 약물없이 세 번 씻으십시오. </li><li> RT에서 1 시간을 위해 0.1 M 인산 버퍼 (PBS, pH를 7.4)에 4 % paraformaldehyde로 망막을 수정. </li><li> 4 박 0.1 M PBS로 씻으 ° C. </li><li> 그 다음날, 반응 with 2% 0.1M PBS에 streptavidin - 알렉사 488 (최종 농도가 10 μg / ML) + 0.3 % 트리톤 X - 100, 4에서 하룻밤 보관 ° C. </li><li> 10 분 각각의 RT에서 0.1M PBS로 세 번 씻어 </li><li> PBS에 좋은 브러쉬를 사용하여 다음 여과지에서 망막을 분리하고, 슬라이드에, 망막, 중심 photoreceptor 쪽 올려 놓습니다. </li><li> 부드럽게 Vectashield 설치 매체 (벡터 연구소, Burlingame, CA)를 탑재합니다. </li><li> 의 범위에서, 당신은 다른 실험 조건 (조명 조건 예를 들어, 테스트 약품)의 효과를 비교할 수 있도록, 모든 실험 조건에 대해 동일한 배율, 해상도 및 설정에 공촛점 현미경 (예 : 자이스 혈구 510 META)을 스캔 레이저로 사진을 찍고 갭 접합 추적기 커플링 (그림 2A - C와 그림. 4A - C). 하나의 이미지가 라벨 세포를 모두 포함할 수 있지만, 그것은 당신이 관심 영역의 Z - 스택을 수집하고 단일로 축소하는 것이 좋습니다이미지. </li></li></ol> 3. ImageJ를 사용하여 추적 커플링의 부량 <ol><li> LSM 이미지 브라우저에서 이미지를 열고 수출 및 파일을 압축되지 TIF - 16 비트로 사진을 저장합니다. 스케일 바이 TIF 이미지에 포함되어야합니다. </li><li> NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 전체 마운트 망막의 낮은 배율 이미지 알렉사 - 488 - 라벨 neurobiotin의 형광 강도를 측정합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 TIF 파일을 열고 다음 규모 표시줄에 해당하는 직선을 그립니다. , ANALYSE로 이동 규모를 설정하고 유명한 거리와 길이 단위를 입력한 다음 확인을 누릅니다. 지금 측정 결과는 같은 밀리미터로 보정 단위로 표시하실 수 있습니다. </li><li> 사각 선택 도구를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 형광의 피크는 선택의 왼쪽 경계에 위치해야합니다. 오른쪽 국경 근처에는 형광 신호가 없다는 것을 확인하십시오. 그렇지 않으면 활성 이미지 (IMAGE 후, 회전)을 돌린다. </li><li> 를 클릭하십시오ANALYSE와 프로필을 플롯. 당신은 오른쪽으로 왼쪽에서 기하 급수적으로 부패와 커브를 볼 수 있습니다. </li><li> 팝업 윈도우에서 복사를 클릭하고 Excel에 붙여 넣으십시오. 이제 당신은 그 상처에서 거리의 함수로 컷 (왼쪽 열)과 형광 강도 (오른쪽 열)에서 거리를 보여주는 두 개의 열이을 참조하십시오. </li><li> 상대 형광 강도를 얻기 위해 최대 형광 값에 의해 각 원시 형광 값을 나누십시오. </li><li> 다음 컷 (X)와 상대 형광 강도 (Y)의 거리에 해당하고, 복사 두 개의 열이는 원산지 소프트웨어에 그들을 붙여 넣습니다. </li><li> 지수 붕괴 형태에 # 1 함수 (. 그림 2D 및 그림 4D)와 맞추기 : Y = Y 0 + Y 최대 * EXP (- X / λ) Y의 상대 형광 강도가 어디 있는지, Y O가 배경 형광이며, Y 맥스가 최대 상대 형광이며, λ은 SP입니다ACE (길이) 상수, 그리고 X는 컷의 거리입니다. </li><li> T - 테스트 또는 ANOVA를 (그림의 2E와 그림. 4E)를 사용하여 다양한 실험 조건에서 공간을 상수 (λ) 값을 비교합니다. 부량의 대체 기법은 다른 13,14에 의해 설명했습니다합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 컷 - 로딩에 의해 결정된 커플링 photoreceptor 세포 추적의 대표 예는 그림 2와 3 (생선)와 그림 4 (토끼)에서 제공됩니다. 공촛점 이미지 컷에서 거리의 함수로 꾸몄다 이상 번호 3.8에 표시된 지수 함수에 의해 장착되었습니다 비교 (그림 2A - C와 그림. 4A - C) 및 형광 강도에 대해 동일한 설정을 사용하여 찍은 (그림 2D 및 그림. 4D). 각 조건에 대한 공간 상수 값간격 접합 추적 커플링의 범위는 컷 로딩 기법을 사용하여 계량 수 보여주는, 2E 및 4E 통계에 표시됩니다. 또한, 그 결과는 매우 재현할 수 있습니다. 간격 접합 추적 커플링의 범위를 quantifying의 수단으로 컷 로딩 기법의 사용이 또한 형광 강도는 모든 경우에 컷에서 거리의 함수로 기하 급수적으로 감소 면요에 의해 검증 것은 (또한 무화과를 참조하십시오. 7,8 검사를 neurobiotin 다른 망막 사이트에서 레이저 컷이 아닌 통해 photoreceptors를 입력한 나타내는 여기에 2D 및 4D). 또한, photoreceptor 세포 추적 커플링의 질적 유사한 주 / 야 차이점은 하나의 원뿔로 추적 주사와 금붕어와 컷로드 7 관찰 photoreceptor 커플링의 범위를 측정 비교적 정확한 방법으로 절단 로딩 substantiates. 컷 - 난oading 기술은 또한 망막에 전기 시냅스의 다른 유형을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 5는 토끼 A - 타입 (그림의 5A)와 B 타입 (그림의 5B) 수평 세포 추적이 결합 동종 전시회를 보여줍니다 다음 절단 하중과 어두운 조건에서 적응 neurobiotin의 확산. <table border="1"><tbody><tr><td> 화합물 </td><td> 물고기 </td><td> 마우스 </td><td> 토끼 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 일 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 3.1 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 일 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td> - </td><td> 일 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> 글루타민 </td><td> - </td><td> 0.1 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0.7 </td><td> 이 </td><td> 이 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 금붕어, 마우스 및 토끼 망막에 대한 울리는의 솔루션 구성. 농도는 MM로 표시됩니다. 벨소리의 솔루션 5 % CO 2 / 95% O 2 부풀어 오른 22 ° C (생선) 또는 36 ° C (포유류)에서 유지됩니다. "-"이 종족에 대한 벨소리에 포함되지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1 :. 컷 로딩 절차를 보여주는 플로우 차트. 절연 O 후F 손상 신경 망막은 여러 가지 방사형 상처가 처음 0.5 % neurobiotin 솔루션있었습니다 칼날에 의해 만들어졌다. 망막은 추적로드 및 확산을위한 incubated 후 0.1M 인산 버퍼 (PB)에 4 % paraformaldehyde (PFA)로 고정하기 전에 세탁했습니다. 추적기 커플링은 알렉사 - 488 streptavidin - 복합 사용하여 조사되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 금붕어의 photoreceptor 추적 커플링에 주간 야간 차이는 컷 로딩 기술에 의해 드러났습니다. Photoreceptor 셀 갭 접합 neurobiotin 추적 커플링 제어 조건 (A)에 따라 하루에없는 spiperone (10 μm의), 선택적 도파민 D 2 수용체 길항제 (C) 응용 프로그램의 다음과 박 (B)에서, 하루에 광범위한했지만. 상처 (AC에 화살표로 표시)에서 거리의 함수로 D) 표준화 상대 형광 강도. E) 우주 상수 발D 및 기타 실험 (n은 = 4)에있는 데이터에서 얻은 ues. *** P &lt;0.001. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. neurobiotin와 rhodamine dextran 모두 솔루션 절단 하중에 따라 야간에 어두운 적응 금붕어 망막의 photoreceptor 세포 레이어에 형광을 보여주는 대표적인 예라고 할 수 있습니다. 높은 분자량 (&gt; 10,000 MW), 컷 근처에만 표시 세포에 의한 열 간격 접합 채널을 통해 확산되지 않습니다 Rhodamine dextran (빨간색 표시). 반면, 갭 분기점을 통해 확산 neurobiotin (녹색 표시)와이 멀리 컷에서 photoreceptor 세포에서 볼 수 있습니다. 절단의 위치는 각 패널에있는 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 : 200 μm의. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 일 밤 다릅니다토끼 망막의 photoreceptor 커플링 추적에 줬어는 컷 로딩 기술에 의해 드러났습니다. Photoreceptor 셀 갭 접합 neurobiotin 추적 커플링 제어 조건 (A)에 따라 하루에없는 spiperone (10 μm의) (C) 응용 프로그램의 다음과 박 (B)에서, 하루에 광범위한했지만. AC에서 컷 근처 토끼 photoreceptors의 3D 재건의 수직의 전경이 표시됩니다. 인하의 거리의 함수로 D) 표준화 상대 형광 강도. E) 우주 상수 값을 D 및 기타 실험 (N = 3)의 데이터에서 얻은. *** P &lt;0.001. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 잘라내기 - 로딩은 어두운 - 적응 토끼 수평 세포 추적이 결합된다 보여줍니다. A - 타입 (A)과 B 타입 모두 (B) 어두운 적응 토끼 망막의 수평 세포가 동종 neurobiotin 추적 커플링을 전시.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에서 설명한 컷로드 방법은 서로 다른 조명 조건과 낮과 밤의 다른 시간대에 망막 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 결정하기 위해 유용하고 간단 방법입니다. 이 기법의 장점은 밤낮 동안 조명 조건의 다양한하에 그대로 망막 조직에서 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 정할 작은 직경 somata을 결합하여 뉴런을 위해 그렇게 할 수있는 능력을 포함합니다. 이 일반적인 범주로 그대로 조직 가을에 갭 분기점의 연구 기법의 한계. 첫째, 개방 간격 분기점을 통해 추적 확산이의) 작은 직경이나 열린 채널과 B) 결합 세포 구획의 상대적 볼륨 1,14,15와 관련된 비용으로 인해 관찰 상대적으로 어려울 수 있습니다. 그것은 작은 세포에서 세포의 결합 큰 셀 또는 그룹 광고에 추적 확산이다큰 세포에서 작은 세포로 추적 확산에 ared, 추적 희석으로 인해 검색하는 것이 더 어려울 수 있습니다. 둘째, 어떤 생리 조건 하에서, 손상 조직의 갭 분기점을 통해 추적 확산의 범위가 정확하게 비교적 큰 추적기의 투자율에 비해 작은 전류 운반 이온의 전도성의 차이로 인해 간격 junctional 전도성의 강도를 반영하지 않을 수 있습니다 분자 1,14,15. 일반적으로 추적 커플링의 증거가 강하게 작동하는 오픈 간격 접합 채널의 존재를 암시하지만, 몇 가지 생리적 조건 하에서, 추적 확산은 electrophysiological 레코딩가 작동, 오픈 간격 분기점의 존재를 제안해도 발생하지 않거나 관찰 수 있습니다. 이것은 컷 로딩 기술은 또한 중추 신경 치세요의 다른 지역에서 그대로 조직에서 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 조사하는 데 사용할 수있는 가능성이 보인다어디서 비롯되었을지.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Tricaine의 메탄 산염 (MS222) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A5040 </td><td> 150 MG / 버퍼 수조 물의 L </td></tr><tr><td> 우레탄 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> U2500 </td><td> 2g / kgloading 복용량 </td></tr><tr><td> 듀얼 튜브 나이트 비전 가글 </td><td> 야간 광학 미국 </td><td> D - 221 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 종이, 학년 제 4 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> 좋은 집게, 11cm 길이 뒤몽 번호 5, Biologie, </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> 좋은 가위, 용수철, 8mm 블레이드, 직선 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 15025-10 </td><td></td></tR&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> 벡터 </td><td> SP - 1120 </td><td> 0.5 % </td></tr><tr><td> Streptavidin - 복합 알렉사 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2퍼센트 </td></tr><tr><td> Dextran rhodamine (높은 (&gt; 10,000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0.5 % </td></tr><tr><td> Vectashield 장착 매체 </td><td> 벡터 </td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 검사 자이스 혈구 510 META 레이저 </td><td> 칼 자이스 혈구, 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM - 5 이미지 브라우저 3,2,0,115 </td><td> 칼 자이스 혈구, 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ 소프트웨어 </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLab 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

잘라내기 -로드 : 망막 뉴런 사이 간격 접합 추적 커플링의 범위를 검토​​를위한 유용한 도구

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

화학 시냅스 전송뿐만 아니라, 갭 분기점에 의해 연결된 뉴런은 전기 시냅스 전송을 통해 빠른 속도로 통신할 수 있습니다. 증거를 늘리면 간격 분기점뿐만 아니라 전류 흐름과 서로 결합하거나 세포 사이의 동기 활동을 허용함을 나타냅니다지만, 결합 세포 사이의 강도 또는 전기 통신의 효율성 좋은 정도의 1,2에 변조된 수 있습니다. 또한, 많은 간격 연결 채널의 큰 내경 (~ 1.2 nm의)는 간격 분기점은 또한 신진 대사 및 화학 통신을 중재 수 있도록, 세포내 신호 분자와 상호 세포 사이의 작은 metabolites의 보급에도 전류 흐름뿐만 아니라 수 있지만, . 뉴런과 신경 전달 물질 및 기타 요인에 의해 자사의 변조 사이의 간격 junctional 통신의 강도가 동시에 전기 결합 세포에서 기록하여 및 t를 결정하여 연구 수하나의 세포에 주입 iontophoretic 다음 그 간격 접합 투과 아르 추적 분자의 확산 범위 아니지만 막 투과. 그러나 이러한 절차는 그대로 신경 조직의 작은 somata와 뉴런에서 수행하는 매우 어려울 수 있습니다. 다섯 망막 신경 세포 유형의 각각 전기 격차 분기점 3,4로 연결되어 있기 때문에 전기적 시냅스 및 전기 통신의 변조에 대한 많은 연구는 척추 망막에서 실시되었습니다. 증가 증거는 빛의 자극에 망막 및 변경에 circadian (24 시간) 시간은 3-8을 결합 간격 접합을 조절하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 최근 작품은 망막 circadian 시계 D2 수용체 활성을 줄임으로써 증가 도파민 D2 수용체의 활성화에 의해 낮에는로드 및 원뿔 photoreceptor 세포 사이의 간격 접합 커플링을 감소하고, 극적으로 야간로드 - 원뿔형 커플링을 증가시킬 수있다는 것을 보여주었다 <suP&gt; 7,8. 그러나,뿐만 아니라 손상 신경 망막 조직의 작은 somata와 뉴런에서 수행하는 매우 어려운 이러한 연구가 있지만, 그것은 충분히 간격 접합에 빛을 유발 변화를 피하기 위해 단일 ​​망막 뉴런의 electrophysiological 공부하는 동안 조명 조건을 제어하기 어려울 수 컨덕턴스. 여기, 우리는 서로 다른 조명 조건과 낮과 밤의 다른 시간대에 망막 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 결정하는 직접적인 방법을 제시한다. 이 컷 - 로딩 기술은 열 간격 접합 채널을 통해 색소로드 및 확산을 기반으로 9-12 다쳤고, 로딩의 수정입니다. 긁어로드는 그대로 망막으로 두꺼운 조각에서 교양 세포에서 잘 작동하지만,하지 않습니다. 컷 - 로딩 기술은 그대로 생선과 포유 동물 망막 7, 8,13에 photoreceptor 커플링을 연구하는 데 사용되었으며, 사이 커플링 공부하는 데 사용할 수 있습니다여기에 설명된 다른 망막 뉴런.

망막 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 결정하는 쉽고 편리한 방법을 설명합니다. 이 기술 하나는 서로 다른 조명 조건과 낮과 밤의 다른 시간대에있는 그대로 망막에있는 뉴런 사이의 전기 시냅스의 기능을 조사 수 있습니다.

화학적 시냅스 전달 외에도, 간극결합으로 연결된 뉴런들은 전기적 시냅스를 통해 신속하게 소통할 수 있습니다...

다음의 절단 로딩(cut loading) 실험의 전반적인 목적은 제어된 조명 조건 하에서 온전한 망막 내 뉴런 간의 갭 결합(gap junction) 추적자 결합 정도를 조사하는 것입니다. 첫 번째 단계는 세포막은 통과하지 못하지만 열려 있는 갭 결합 채널을 통해 확산될 수 있는 추적자 분자인 뉴로비오틴(neuro biotin) 용액에 담근 날카로운 칼날로 망막을 절단함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서 망막을 링거액(ringer's solution)에 배양하면, 열려 있는 갭 결합 채널을 통해 추적자가 확산됩니다.갭 접합 결합(gap junction coupling)이 약한 경우, 뉴로 바이오틴 형광은 절단 부위 근처의 망막 뉴런에만 국한될 것입니다. 반대로, 갭 접합 결합이 강한 경우에는 절단 부위에서 멀리 떨어진 망막 뉴런에서도 형광이 검출될 것입니다. 기존 기술보다 컷 로딩(cut loading) 방식이 갖는 주요 장점은 온전한 망막 신경 조직 내의 세포체가 작은 뉴런에 더 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다.또한, 절편 로딩 중의 조명 조건을 제어하는 것은 온전한 망막 조직 내 단일 뉴런의 전기생리학적 연구 중에 제어하는 것보다 더 쉽습니다. 전기적 기록 중에 사용되는 빛 자극 자체가 간극 결합(gap junction coupling)의 변화를 유도할 수 있으므로, 본 기술의 시연은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Chu Choi이 진행하겠습니다. 이 절차에서는 수술 전 최소 1시간 동안 금붕어를 낮 시간대에 지속적인 암흑 상태로 유지하며, 망막 조직이 고정될 때까지의 모든 후속 단계 또한 낮 시간의 지속적인 암흑 상태에서 수행합니다. 어항 물에 150 milligrams per liter methane sulfonate를 첨가하여 금붕어를 깊게 마취시킵니다.그 다음, 연방 및 대학 지침에 따라 금붕어를 희생시키고 안구를 조심스럽게 적출합니다. 이어서 각 안구의 전방부를 제거합니다. 그런 다음 안구 후방부 위에 거름종이 한 조각을 올리고, 거름종이가 안구 후방부 아래에 오도록 거름종이와 안구를 뒤집습니다.이제 암순응된 금붕어에서 공막과 색소상피를 포함한 안구 후방 조직을 조심스럽게 제거합니다. 미세 가위로 망막의 시신경을 절단합니다. 안구에서 온전한 신경망막을 박리한 후, 광수용체 층이 위로 향하도록 신경망막을 거름종이에 부착합니다. 그동안 마취 상태인 물고기를 6-웰 플레이트의 각 웰에 테스트 약물 포함 여부에 따라 5 mL의 탄산염 기반 링거 용액(산소 공급됨)과 함께 배치합니다.지속적인 암실 상태에서 망막을 웰로 옮깁니다. 그런 다음 파라폼(paraform)으로 웰을 밀봉하고 조직을 30분 동안 배양합니다. 망막을 절단하기 직전에 0.5% neuro biotin을 링거액(ringer solution)에 녹여 100 µL의 추적자 용액을 준비합니다.다음으로, neuro biotin 용액을 유리 페트리 접시에 넣습니다. 그다음 망막이 부착된 여과지를 종이 타월 위에서 가볍게 두드립니다. 과잉의 ringers 용액을 제거하기 위해, 면도날을 neuro biotin 용액에 담근 후 망막과 여과지를 수직 방사형으로 절개합니다.그 후, 면도날을 neuro biotin 용액에 다시 담그고 망막을 두 번째로 절단합니다. 이 과정을 망막당 최대 4회 반복합니다. 이 단계에서 망막을 시험 약물이 포함되었거나 포함되지 않은 신선한 ringers medium으로 옮겨 15분 동안 로딩 및 확산이 이루어지도록 합니다.신선한 Ringer 용액 또는 시험 약물이 포함되었거나 포함되지 않은 배지로 각각 5분씩 3회 세척합니다. 그 후, 실온에서 0.1 M 인산 완충액 내 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 망막을 1시간 동안 고정합니다. 이어서 망막을 0.1 M PBS로 세척하여 4°C 냉장고에 보관하며 하룻밤 동안 둡니다.0.1 molar PBS 및 0.3% Triton X 100에 2% streptavidin Alexa 488을 최종 농도 10 micrograms per milliliter가 되도록 혼합하여 망막과 반응시킨 후 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 실온에서 0.1 molar PBS로 망막을 10분씩 총 3회 세척합니다.PBS 내에서 필터 페이퍼로부터 망막을 분리합니다. 그 다음 미세 붓을 사용하여 vector shield 마운팅 용액이 도포된 슬라이드 위에 망막의 광수용체 쪽이 위로 향하게 마운트합니다. 슬라이드를 레이저 주사 공초점 현미경으로 옮기고, 모든 실험 조건에 대해 동일한 배율, 해상도 및 설정으로 사진을 촬영하여 서로 다른 실험 조건이 gap functional tracer 결합 정도에 미치는 영향에 대한 비교가 가능하도록 합니다.선택적 도파민 D2 수용체 길항제가 존재할 때의 지속적 암흑 상태 낮 시간대와 비교하여, 지속적 암흑 상태 낮 시간대 동안의 광수용체 세포 추적자 결합 범위입니다. 두 이미지 모두 왼쪽의 면도날 절단 부위를 확인하십시오. 단일 이미지에 모든 표지 세포가 포함될 수 있으나, 관심 영역의 Z-스택을 수집하여 표시된 것과 같이 단일 이미지로 투영하는 것을 권장합니다.Zack을 따라 순차적으로 이동함에 따른 광수용체 세포 추적자 결합의 범위를 보여줍니다. 이 이미지에서 면도날 절단면은 오른쪽에 있음에 유의하십시오. LSM 이미지 브라우저에서 추적자 결합 범위를 정량화하려면, 이미지를 연 후 export를 클릭하여 사진을 16비트 비압축 TIF 파일로 저장하십시오. NIH Image J 소프트웨어를 사용하여 이 TIFF 이미지에 스케일 바를 포함해야 합니다.홀 마운트(hole mount) 망막의 저배율 이미지에서 Alexa 4 88로 표지된 뉴로-비오틴(neuro biotin)의 형광 강도를 측정합니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 TIFF 파일을 연 다음, 스케일 바에 해당하는 직선을 그립니다. 이어서 analyze, set scale로 이동하여 알려진 거리와 길이 단위를 입력합니다.그런 다음 확인을 클릭합니다. 이제 형광 측정값을 밀리미터(mm)와 같은 보정된 단위로 표시할 수 있습니다. 이후 사각형 선택 도구를 사용하여 관심 영역을 선택하십시오.형광 피크가 선택 영역의 왼쪽 경계에 위치하도록 설정하십시오. 오른쪽 경계 근처에 형광 신호가 없는지 확인하십시오. 지속적인 암흑 상태에서 얻은 주간 대조군 데이터에 대해 analyze and plot profile을 클릭하십시오.왼쪽에서 오른쪽으로 지수 감소 곡선이 표시됩니다. 그런 다음 팝업 창에서 복사를 클릭하고 엑셀(Excel)에 붙여넣으십시오. 이제 절단면으로부터의 거리와 거리의 함수로서의 형광 강도를 나타내는 두 개의 열이 생성됩니다.비교를 위해, 위 단계들을 낮 동안 지속적인 암흑 상태에서 얻은 데이터로 반복합니다. spit bro가 있는 경우, 각 원시 형광 값을 최대 형광 값으로 나누어 상대적 형광 강도를 구합니다. 절단 부위로부터의 거리와 상대적 형광 강도에 해당하는 두 열을 복사하여 origin 소프트웨어에 붙여넣습니다.이 단계들은 주간 대조군과 주간 분무군 모두에 대해 나타나 있습니다. 이 시점의 데이터를 사용하여 결과값을 지수 함수적 감쇄(exponential decay) 1번 함수로 피팅합니다. T-검정 또는 ANOVA를 사용하여 서로 다른 실험 조건에서의 시상수(space constant) 값들을 비교하십시오.비교를 위해 주간 대조군, 주간 pip rone 및 야간 대조군 데이터의 지수 함수 및 통계 분석 결과가 제시되었습니다. 여기서는 컷 로딩(cut loading) 기법으로 확인한, 암적응된 금붕어 망막 내 광수용체 세포 추적자 결합 정도의 예시가 제시되어 있습니다: 주간 A, 야간 B, 그리고 선택적 도파민 D2 수용체 길항제인 one이 존재하는 상태의 주간 결과입니다. 모든 공초점 이미지는 비교를 위해 동일한 설정으로 촬영되었습니다.이 그래프에서는 세 가지 실험 조건에 따른 형광 강도를 절단 부위로부터의 거리의 함수로 나타내고, 이를 지수 함수로 피팅하였습니다. 컷 로딩(cut loading) 기법은 여기서 세 가지 실험 조건에 대해 보여주는 것과 같이 공간 상수 값을 계산함으로써 갭 결합 추적자 커플링(gap junctional tracer coupling)의 정도를 정량화하는 데 사용됩니다. 컷 로딩 기법은 또한 망막 내의 다른 세포 유형 간 또는 다른 종의 세포 간 전기적 시냅스를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.예를 들어, 이 두 그림은 암적응 조건 하에서 절단 적재(cut loading) 후 neuro biotin의 확산에 따라 토끼의 A형 및 B형 수평세포가 상동 트레이서 결합(homologous tracer coupling)을 나타냄을 보여줍니다. 우리는 주간과 야간에 간상세포와 원추세포 사이의 간극결합(gap junctions)을 통한 트레이서 확산 정도를 연구하기 위해 절단 적재 기술을 사용했습니다. 또한, 이 기술은 다른 망막 뉴런 간의 트레이서 결합이 망막 시계나 특정 명암 조건에 의해 조절되는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있습니다.또한 이를 사용하여 다른 뇌 영역에 있는 뉴런 간의 추적자 결합(tracer coupling)을 연구할 수도 있습니다.

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

우리는 뉴런이나 폴리에틸렌 흡입 피펫을 사용하여 모든의 연결을 요로에 형광등과 칼슘에 민감한 염료의 높은 농도를 도입을위한 간단하고 저렴한 비용으로 기술을 설명합니다.

신경, 책자, 그리고 형광 염료와 척수 뿌리 역행로드

면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

이 프레젠테이션은 세포간 접합 통신 연구에 부착 배양된 세포의 전기천공법이 사용되는 방법을 보여주며, 세포는 전도성 및 투명 인듐-주석 산화물로 코팅된 슬라이드에서 성장합니다.

갭 접합부 시험에 대한 기능 분석; 인듐 - 주석 산화물에 자기편 세포의 전기 천공 법 (electroporation)

이 프로토콜은 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 기술에 대해 설명합니다. 갭 접합부 간 통신은 조직의 항상성을 유지하고이 세포 신호의 중단은 건강에 악영향을 갖고있는 중요한 세포 과정이다.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.

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여기에서는 칼슘에 민감한 염료를 개구리 신경 그루터기를 통해 신경 종말로 삽입하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 말초 신경 말단에서 빠른 칼슘 과도 현상의 기록과 분석을위한 프로토콜을 제시합니다.

칼슘 염료를 개구부 신경 절편에 삽입하기 : 신경 개구부를 통해 개구리 신경 근육 계통에서 칼슘 과도 등록

여기 astrocytic 네트워크의 조직 평가 프로토콜 선물이. 설명된 방법 셀 수, 크기, 지역, 및 핵 내의 위치 등이 네트워크의 기술적인 조치를 제공 하는 바이어스를 최소화 합니다. 이방성 vectorial 분석 평가 이다.

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여기, 우리 소설 간격 접속점 세포 통신 분석 결과 갭 정션 변조 화학 약물 발견 및 독성 평가의 높은 처리량 검열에 대 한 설계에 대 한 프로토콜을 제시.

요오드 화물-노랑 형광 단백질-간격 접속점 세포 통신 분석 결과

이 연구는 광수용체 세포체를 제거함으로써 면역조직화학, in situ hybridization 및 전기생리학 실험을 위해 더 빠른 항체 확산과 내부 망막 뉴런에 대한 패치 피펫 접근을 개선할 수 있는 대체 편평 장착 망막 제제를 제시합니다.

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

학습하세요 망막 뉴런 간 간극 접합 추적 결합 범위를 조명 조건에서 평가하는 컷 로딩 기법을. 이 방법은 작은 세포체를 가진 뉴런 연구에 유용하며 신경 세포 간 통신 메커니즘 이해에 기여합니다.

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