Name: Zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ T 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 배우세요 조레드로네이트와 IL-2를 사용하여 사람 말초혈에서 γδ T 세포를 대규모 확장하는 방법을. 이 기술은 암 면역치료를 위한 자가세포치료에 적용 가능합니다.

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1. PBMC의 분리 <ol><li> BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 헤파린과에 혈액 (7.5-8.0 ML)를 그립니다. 튜브는 나트륨 헤파린의 항응고제와 Ficoll - Hypaque 밀도 유체, 더하기 두 액체를 분리 폴리에스터 겔 장벽을 포함하고 있습니다. 1,800 X g에서 20 분 수평 로터 (스윙 아웃 헤드)에 실온 (18 ° C 25 ° C)에서 튜브 / 혈액 샘플을 원심 분리기. 브레이크를 원심 분리기 전환합니다. </li><li> 원심 분리 후, 레이어의 순서 (위에서 아래에서 본) 다음과 같이 발생합니다 :) 플라즈마 - B) 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)과 혈소판 - C) 밀도 솔루션 - D) 폴리에스터 겔 - E) granulocytes - F) 적혈구 (그림 1). </li><li> 셀 계층을 방해하지 않고 계면 위의 플라즈마의 5~10mm를 떠나, 플라즈마 층의 일부를 수집합니다. 플라즈마는 문화 (섹션 2.5)을 위해 사용될 수 있습니다. </li><li> 15 ML 원뿔 관에 피펫 및 이전과 계면에서 농축 분율 (PBMC)를 수확. </li><li> 10 ML과 PBMC을 씻 는다 인산염 버퍼 반전 튜브에 의해 생리 (PBS), 5 번, 그리고 400 X g에서 5 분 원심 분리기. </li><li> 두 번 세척 단계를 반복한 다음 PBS 5 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. 휴대폰 번호를 확인합니다. 보통 1.3 X10 6 셀은 전체 혈액의 1 ML에서 회복됩니다. </li><li> 주파수 및 유동세포계측법 (섹션 3) (그림 2)에 의해 PBMC에서 γδ T 세포의 표현형를 결정합니다. </li></ol> 2. γδ ​​T 세포의 확장 <ol><li> 상온에서 400 X g에서 5 분 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 원심 분리기 suspensions하고 supernatants 폐기하십시오. </li><li> 각각 1000 IU / ML 5 μm의 최종 농도에 인간 IL - 2 (IL - 2)와 zoledronate (Zometa)를 추가하여 문화 매체 (CM)를 준비합니다. ALyS203 (셀 과학 기술 연구소) 또는 OpTmizer (Invitrogen) 미디어 γδ T 세포 (참조 6 9 자세한 정보)의 좋은 확장을 지원합니다. Zometa는 액체 형태 (4 mg/5-ml의 약병)에 제공됩니다. 5 μm의 솔루션을 준비하려면, 문화 매체의 30 ML에 Zometa 50 μl를 추가합니다. </li><li> Resuspend 문화 매체 세포 펠릿 및 1x10 6 세포 / ML을 조절할 수 있습니다. </li><li> 24 - 잘 플레이트의 각 우물에 1x10 6 세포를 포함하는 CM의 Pipet 1 ML. 대규모 문화, 전지 판 우물, 요리,이나 플라스크의 표면 영역에 따라이 0.5 X 10 6 세포 / cm에서 씨앗을하실 수 있습니다. </li><li> 그것은 문화의 볼륨 (24 잘 플레이트의 각 물론 100 μl)의 약 10 % 있도록 autologous 플라즈마 (섹션 1.3), 풀링 인간 AB 세라, 또는 FCS를 추가합니다. humidified 37 접시를 놓고 ° C 5 % 24-48 시간에 대한 CO 2 배양기. </li><li> 0.5-2 X 10 6 세포 / ML의 세포 밀도의 문화를 유지합니다. 신선한 매체마다 2-3일 인간 IL - 2 (1000 IU / ML) 전용 (Zometa없이)이 포함된 추가하고, 세포 증식의 정도 (그림 3)에 의하면, 새로운 우물하거나 필요한만큼 flasks으로 교양 세포를 전송합니다. 공급 플라즈마 또는 혈청 농도가 적어도 1% 유지 수 있도록 매체 혈청. </li><li> 일 12-14과 주파수, 표현형 및 유동세포계측법에 의해 γδ T 세포 (아래 참조)의 기능을 결정에 수확 세포. </li></ol> 3. 유동세포계측법에 의해 Phenotypic 분석 <ol><li> 형광 - 활성화된 셀 정렬 (외과) 튜브 2 X 10 5 세포를 포함하는 200 μl 샘플을 전송합니다. </li><li> 차가운 PBS 2 ML 추가 400 X g에서 5 분 원심 분리기. 그런 다음, 50 μl 외과 버퍼 (PBS + 1% FCS + 0.1 %의 나트륨 azide)에 알약을 resuspend. 샘플 (단클론 항체가 표 1에 나와 있습니다) 각 항체의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 20 분 동안 짙은 어둠 속에서 얼음 품어. </li><li> 각 샘플 2 ML의 외과 버퍼를 추가한 다음 소용돌이. 4 400 X g ° C.에서 5 분 원심 분리기 샘플 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 300 μl 외과 버퍼와 와동에있는 세포를 Resuspend. 흐름 cytometer (그림 2)에서 샘플을 분석할 수 있습니다. </li></ol> 4. IFN - γ 생산 분석 10 <ol><li> 분석 전날, RPMI 1640 미디어 플러스 Zometa (5 μm의) (이하 Z - Daudi 지정)과 하룻밤 10% FCS (RPMI - 10)에 culturing 3-5 X10 5 Daudi 세포 / ML로 자극기 전지를 준비합니다. </li><li> 2x10 6 셀 / ML에서 RPMI - 10 Z - Daudi 및 resuspend를 수집합니다. 둥근 바닥 96 - 웰 플레이트의 각 잘하는 Z - Daudi (2x10 5) 100 μl를 추가합니다. </li><li> RPMI - 10은 20 μg / ML에서 Brefeldin를 포함에 2x10 6 셀 / ML에서 γδ T 세포를 준비합니다. 각 잘 포함 Z - Daudi 전지에 γδ T 세포 현탁액 (2x10 5) 100 μl를 전송하거나 우물 (100 단 RPMI - 10 μl, 또는 phorbol 20 NG / ML 12 - myristate 13 - 아세테이트와 RPMI - 10 제어[PMA] 플러스 2 μg / ionomycin의 ML). </li><li> 몇 시간을 아래와 pipetting하여 섞는다. 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 4 시간을위한 부화. </li><li> 4 ° C에서 400 X g에서 5 분 접시를 원심 차가운 PBS 200 μl의 알약을 resuspend. </li><li> 외과 튜브에 샘플을 전송합니다. 차가운 PBS 4 ML을 추가하고 4 400 X g에서 5 분 튜브를 원심 ° C. </li><li> FITC - 복합 백신 TCRVγ9 (5 μl)와 PE/Cy5-conjugated 안티 인 경우에는 3 번 CD mAb (2.5 μl)와 외과 버퍼의 50 μl의 알약을 Resuspend. 부화는 실온에서 15 분 빛으로부터 보호. </li><li> IntraPrep 시약 1 100 μl를 추가하고 실온에서 15 분 알을 품다. 상온에서 400 X g에서 5 분 각 튜브와 원심 분리기에 PBS 4 ML을 추가합니다. </li><li> 흡인에 의해 표면에 뜨는를 제거하고 IntraPrep 시약 2 100 μl를 추가합니다. 떨지 않고 상온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 테스트 튜브에 PE - 복합 백신 IFN - γ mAb 5 μl를 추가합니다. 부화는 실온에서 15 분 빛으로부터 보호. </li><li> 상온에서 400 X g에서 5 분 각 튜브와 원심 분리기에 PBS 4 ML을 추가합니다. 흡인에 의해 표면에 뜨는를 제거하고 외과 버퍼의 0.5 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 흐름 cytometer에 의한 세포를 분석할 수 있습니다. 인 경우에는 3 번 CD + TCRVγ9 + 세포에서 IFN 게이트 - γ (그림 4)의 표현을 확인합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 문화의 개시에 PBMC에서 γδ T 세포의 비율을 결정하는 것이 중요합니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 2 A, 인 경우에는 3 번 CD + TCRVγ9의 비율은 + PBMC에서 γδ T 세포는 하루에 0에 1.6 %되었습니다. 중앙 메모리 phenotypes - 지배 집단은 CD27 + CD45RA + 순진한 또는 CD27 + CD45RA했다. γδ T 세포가 효율적으로 자극되었을 때, 그들은 (그림 3 A와 B) 일 3-5에 클러스터를 형성. 클러스터 형성이 지연되었을 때, 같은 다른 세포 유형의 성장 CD4 + 또는 CD8 + αβ T 세포 또는 NK 세포가 γδ T 세포 (그림 3 C 및 D)의 성장을 지배 수 있습니다. 문화 날로부터 14 일 후, γδ T 세포의 빈도가 성공적으로 γδ T 세포 배양 (그림 2 E)에서 교양 세포의 이상이 93.8 %로 증가했다. 교양 γδ T 세포 upregulated NKG2D 및 CD69 표현 (그림 2 G 및 H). 그들은 CD27 표시 - CD45RA - 효과기 메모리 표현형 (그림 2 F). γδ ​​T 세포의 기능이 시토킨 생산 및 세포 독성에 관한 평가했다. 세포내 IFN - γ 얼룩 γδ T 세포는 PMA / ionomycin 치료 또는 Z - Daudi 세포에 대한 응답으로 IFN - γ를 생산 것을 입증되는 zoledronate 치료 후 누적된 IPP (그림 4). 이러한 결과는 zoledronate 효율적으로 자극하고 기능 γδ T 세포를 확장할 수 있음을 나타냅니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 튜브 </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> ECD </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 인 경우에는 3 번 CD에 들어 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 인 경우에는 3 번 CD에 들어 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 인 경우에는 3 번 CD에 들어 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> 인 경우에는 3 번 CD에 들어 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> 마우스 IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> 마우스 IgG1 </td><td> 마우스 IgG1 </td></tr></tbody></table> 표 1. γδ T 세포의 여러 가지 빛깔의의 얼룩에 사용되는 단클론 항체. 우리 연구실에서 수행 γδ T 세포의 phenotypic 분석 예제는 그림에 표시됩니다. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. PBMC의 분리. 블러드 (7.5-8.0 ML)은 BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 헤파린과에 직접 그려 1,800 X g에서 20 분 centrifuged입니다. 원심 분리 후, 같은 결과 레이어는 처음부터 보로 볼 수ttom :) 플라즈마 - B) PBMC 및 혈소판 - C) 밀도 솔루션 - D) 폴리에스터 겔 - E) Granulocytes - F) 적혈구. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. γδ T 세포의 일반적인 표면 표현형. PBMC는 14 일 동안 zoledronate 및 IL - 2와 함께 자극했다. 세포와 스테인드되었습니다 FITC - 라벨 안티 TCR γδ T Vγ9 및 세포 (A와 E)의 확장을 모니터하는 안티 - 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE/Cy5-labeled. γδ ​​T 세포는 TCRVγ9 자신의 표현으로 식별되었고, CD27 및 CD45RA (B와 F), NKG2D (C와 G), 또는 CD69 (D 및 H) 자신의 표현을 조사했다. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 대표 γδ T 세포 문화. PBMC는 IL - 2 (1000 IU / ML) 및 zoledronate (5 μm의)와 자극했다. 대표 필드 (IX71 거꾸로 현미경 [올림푸스] X 200) 표시됩니다. γδ ​​T 세포의 클러스터 및 집계는 γδ T 세포가 성공적으로 확장되었습니다 3 일 (A)과 5 일 (B)에 볼 수 있습니다. γδ ​​T 세포 성장 (C 및 D) 충분하지 때 대조적으로, 어떤 클러스터 또는 집계는 관찰되지 않았습니다. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. IFN - γ 생산. γδ ​​T 세포는 RPMI - 10 (A) 또는 PMA / ionomycin (B) 또는 4 시간에 대한 Z - Daudi (C)와 incubated했다. 첫째, TCRVγ9의 표면 표현은 스테인드했습니다 그리고 IFN - γ 생산 세포내 IFN - γ 염색법에 의해 조사되었다. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. γδ T 세포 문화의 속도론. 교양 세포 (A) 절대 번호, (B) γδ T 세포, 그리고 지정된 시간 지점에서 γδ T 세포 (C) 절대 번호의 비율입니다.

<ol><li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3+T+cell+effector+functions%3A+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li>
<li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%28E%29-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li>
<li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+cell+receptor+%CE%B3%CE%B4+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li>
<li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li>
<li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP%2FDMAPP%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li>
<li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+%CE%B3%CE%B4+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li>
<li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+%CE%B3%CE%B4+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li>
<li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate%2C+a+potent+stimulator+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+%CE%B3%CE%B4+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li>
<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기서 제시하는 방법은 PBMC에서 γδ T 세포의 효율적인 확장이 가능합니다. γδ ​​T 세포가 활성화되고 확대 zoledronate로와 IL - 2는 시토킨 생산 및 세포 독성에 의해 반사 완료 효과기 기능을 개발할 수 있습니다. 그것은보고되었음을 합성 phosphoantigens의 bromohydrin 나트륨 (BrHPP) 및 2 - 메틸 - 3 - butenyl - 1 - 나트륨 (2M3B1PP)는 또한 γδ T 세포를 확장하고 있지만, 그들은 상업적으로 사용할 수 없습니다. 대조적으로, zoledronate 이미 Zometa으로 임상 응용에 대한 라이센스입니다. 따라서 신뢰할 수있는 시약을 쉽게 사용할 수 있습니다. 문화 미디어 및 혈청의 선택은 중요합니다. 이러한 ALyS203 (셀 과학 기술 연구소) 또는 성공 γδ T 세포 확장을위한 OpTmizer (Invitrogen)와 같은 적절한 문화 미디어를 사용합니다. 11 그 autologous...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> 노바티스 제약 K. K </td><td></td><td> zoledronate </td></tr><tr><td> PROLEUKIN </td><td> 노바티스 제약 </td><td></td><td> 인간 재조합 IL - 2 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 헤파린과 함께 </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203 - 중간 </td><td> 셀 과학 기술 연구소 </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> brefeldin </td><td> 시그마 </td><td> B5936 - 200UL </td><td></td></tr><tr><td> phorbol 12 - myristate 13 - 아세테이트 (PMA) </td><td> 시그마 </td><td> P1585 - 1MG </td><td></td></tr><tr><td> ionomycin </td><td> 시그마 </td><td> 13909 - 1ML </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 인 경우에는 3 번 CD - FITC 또는 PE/Cy5 </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 CD4 - ECD </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> 6,604,727 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 CD8-PE/Cy5 </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> 6,607,011 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 CD14-PE/Cy5 </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 CD19 - PE </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 CD45 - ECD </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 CD56-PE/Cy5 </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 TCRαβ - PE </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 인간 TCR - FITC Vγ9 </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 CD27-PE/Cy5 </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> 6,607,107 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 CD45RA - ECD </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 CD69 - PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 인간 NKG2D - PE </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 humal IFNγ - PE </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 IgG1 isotype 제어 PE </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 IgG1 isotype 제어 ECD 또는 PE/Cy5 </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ t 세포

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

인간 γδ T 세포가 인식하고 스트레스 유발 항원의 다양한 반응, 따라서 본래 광범위한 안티 종양 및 안티 infective 활동을 개발하고 있습니다. 말초혈에서 γδ T 세포의 1 대부분 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체 있습니다. 이러한 세포의 주요 histocompatibility 복합 독립적인 방식으로 항원을 인식하고 강한 cytolytic과 Th1과 같은 이펙터 기능을 개발할 수 있습니다. 1 따라서, γδ T 세포가 암 immunotherapy에 대한 매력적인 후보 효과기 세포 수 있습니다. Vγ9Vδ2 T 세포 같은 phosphoantigens에 대응 (E) -4 - 히드록시 -3 - 메틸 -하지만 - 2 - enyl 나트륨 (HMBPP), isoprenoid 생합성 통해 박테리아에 합성하는, 생산 2 isopentenyl 나트륨 (IPP), mevalonate 경로 3. 생리적 조건을 통해 진핵 세포에서 nontransformed 셀에 IPP의 세대 γδ T 세포의 활성화를 위해 충분하지 않습니다. 종양 세포에서 mevalonate 경로의 Dysregulation는 IPP의 축적과 γδ T 세포의 활성화로 연결됩니다. 3 aminobisphosphonates (예 : pamidronate 또는 zoledronate 등) farnesyl 나트륨의 synthase (FPPS), mevalonate 경로에서 IPP의 하류를 연기 효소의 세포내 수준을 억제하기 때문에 IPP 및 γδ T 세포 인식에 sensitibity는 therapeutically aminobisphosphonates 증가 수 있습니다. IPP 축적 aminobisphosphonates와 γδ T 세포를 활성화하여 암 우리에게 immunotherapy 수 aminobisphosphonates의 pharmacologically 관련 농도와 종양 세포보다 nontransfomred 세포에 덜 효율적이다. PBMC는 aminobisphosphonates로 치료하는 경우 4 흥미롭게도, IPP 때문에 효율의 monocytes에 쌓입니다 이러한 세포로 약물 이해. IPP 항원 제시 세포되고 주변 혈액에 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극 축적 5 Monocytes가 6. 이러한 메커니즘을 바탕으로, 우리는 zoledronate와 인터루킨를 사용하여 γδ T 세포 문화의 대규모 확장을위한 기술을 개발 -2 (IL - 2). γδ T 세포의 확장 7 다른 방법은 합성 phosphoantigens의 bromohydrin 나트륨 (BrHPP) 8 2 - 메틸 - 3 - butenyl - 1 - 나트륨 (2M3B1PP)를 활용 9. 이러한 방법 중 모든 전 수 입양 immunotherapy에 사용하기 위해 γδ T 세포의 다수의 결과로 생체내 확장. 단, zoledronate은 FDA의 승인을 상용 시약입니다. CD45RA - - Zoledronate - 확장 γδ T 세포는 CD27 표시 효과기 메모리 표현형과 그들의 기능은 IFN - γ 생산 분석 7 평가할 수 있습니다.

주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)에서 γδ T 세포를 확장하는 방법을 설명합니다. PBMC - 파생 γδ T 세포는 자극과 zoledronate과 인터루킨 - 2 (IL - 2)를 사용 확장됩니다. γδ ​​T 세포의 대규모 확장이 암의 autologous 세포 immunotherapy에 적용할 수 있습니다.

Zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ T 세포

인간 $\gamma\delta$ T 세포는 광범위한 스트레스 유도 항원을 인식하고 이에 반응할 수 있으며, 이를 통해 선천적인 광범위 항종양 및...

본 영상에서는 zoledronate를 이용한 인간 말초혈액 감마 델타 T 세포의 대규모 증식 방법을 보여줍니다. 먼저, 전혈을 밀도 구배 원심분리하여 말초혈액 단핵구(PBMCs)를 분리합니다. 분리된 PBMCs에 zoledronate를 처리하여 단핵구가 항원 제시 세포가 되도록 유도하고, IL-2를 함께 처리하여 감마 델타 T 세포를 자극합니다.감마 델타 T 세포를 증식시키기 위해 세포를 최대 14일 동안 배양합니다. 유세포 분석을 통한 배양 분석 결과, 수확된 세포의 대부분이 CD3 양성 Vγ9 양성 표현형을 나타내는 것으로 확인되었습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 Zometa에서 이미 임상 적용 승인을 받았다는 점입니다.따라서 임상 등급의 감마 델타 T세포 조제를 위한 신뢰할 수 있는 시약을 쉽게 사용할 수 있으며, 이는 해당 절차가 makoto condo 및 amichi izumi 세포 배양법에 따라 수행될 것임을 보여줍니다. 본 연구실의 기술진은 나트륨 헤파린 항응고제와 고밀도 액체, 그리고 두 액체를 분리하는 폴리에스터 겔 장벽이 포함된 BD vacutainer CPT 세포 조제 튜브에 수집된 전혈에서 말초혈액 단핵세포를 분리함으로써 이 절차를 시작합니다. 샘플을 실온에서 수평 스윙 버킷 로터를 사용하여 1800 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 브레이크를 끄면 튜브의 내용물이 다섯 개의 층으로 분리됩니다.맨 위의 노란색 층은 혈장으로 구성됩니다. 그 아래의 하얀색 층에는 말초혈액 단핵구와 혈소판이 포함되어 있으며, 이는 더 연한 노란색의 밀도 구배 용액 위에 위치합니다. 흰색의 폴리에스테르 겔 층이 이를 과립구 층과 분리하며, 과립구 층은 회색 층을 형성하여 튜브 바닥의 적혈구 위에 놓이게 됩니다.2 mL 피펫을 사용하여 인터페이스 위에 5~10 mm의 혈장 층을 남겨두고 혈장 층의 일부를 조심스럽게 채취하여 15 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 배양에 사용할 수 있도록 해당 튜브를 4 °C에 보관합니다. 다음으로, 2 mL 피펫을 사용하여 인터페이스에 농축된 PBMC 층을 수확하여 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다.PBMC를 세척하려면 PBS 10 milliliters를 첨가하고 튜브를 5회 반전시킵니다. 그 다음 400 times G에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 세척 단계를 2회 반복합니다. 이후 5 milliliters의 PBS로 세포 펠릿을 재현탁한 다음, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.일반적으로 전혈 1 mL에서 1.3 × 10⁶개의 세포를 회수합니다. 1 × 10⁶개의 세포를 포함하는 PBMC 분획을 분리하여 얼음 위에 보관합니다. 이는 유세포 분석을 통한 분석을 위한 것입니다.PBMC 샘플 내의 gamma delta T 세포를 증식시키기 위해, 15 mL 원뿔형 튜브에 담긴 세포 현탁액을 실온에서 400 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 1000 IU/mL IL-2와 5 µM zoledronate가 첨가된 세포 배양 배지에 세포를 1 × 10⁶ cells/mL의 밀도로 재현탁합니다. Zoledronate는 단핵구의 farnesyl pyrophosphate synthase를 억제하여 isopentenyl pyrophosphate의 축적을 유도하고 단핵구가 항원 제시 세포로 전환되도록 합니다.다음으로 피펫을 사용하여, 10⁶ cells/mL 농도의 배지가 포함된 용액 1 mL를 24-웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 세포 밀도는 0.5 × 10⁶ cells/cm²가 되어야 합니다. 따라서 더 큰 배양 규모의 경우, 24-웰 플레이트의 각 웰에 맞게 비율을 조정하여 분주하십시오.이전에 수집한 100 µL의 자가 혈장, 풀링된 인간 AB형 혈청 또는 FBS 중 하나를 첨가합니다. 플레이트를 습도가 유지되는 37 °C, 5% CO₂ 배양기에 넣고 2~3일마다 교체합니다. 배지를 1000 IU/mL의 인간 IL-2가 첨가된 신선한 혈청 보충 배지로 교체합니다.세포 밀도가 0.5에서 2×10⁶ cells/mL에 도달하면, 새로운 웰이나 플라스크에 1:2 비율로 분할 배양합니다. 며칠 동안 세포를 관찰하십시오. 여기 보시는 것은 0일 차의 세포 모습입니다.더 작은 세포들은 림프구입니다. 더 큰 세포들은 단핵구입니다. 약 24시간 후, 단핵구들이 웰 바닥에 부착됩니다.이틀 후 일부 림프구가 단핵구에 부착되며, 3일째에는 감마 델타 T 세포가 군집을 형성하기 시작합니다. 5일째에는 세포의 거대 군집을 확인할 수 있습니다. 이와 대조적으로, 감마 델타 T 세포의 성장이 적절하지 않을 때는 군집이나 응집체가 관찰되지 않습니다. 군집 형성이 지연될 때입니다.여기서 보시는 바와 같이, CD4 양성 또는 CD8 양성 $\alpha\beta$ T 세포나 NK 세포와 같은 다른 세포 유형의 성장이 $\gamma\delta$ T 세포의 성장을 압도합니다. 12~14일 차에 10 mL 피펫으로 세포를 충분히 피펫팅하고 50 mL 원뿔형 튜브에 세포를 수확합니다. 이제 유세포 분석법을 통해 $\gamma\delta$ T 세포의 빈도, 표현형 및 기능을 분석할 수 있습니다.PBMC 또는 확장된 gamma delta T 세포의 표현형 분석을 수행하려면, 먼저 2×10⁵개의 세포가 포함된 200 µL 샘플을 9개의 유세포 분석(FACS) 튜브에 각각 옮깁니다. 냉각된 PBS 2 mL를 추가하고 400 ×g에서 5분간 원심분리한 후, 펠렛을 50 µL의 FACS 버퍼에 재현탁합니다. 각 샘플에 필요한 항체를 각각 5 µL씩 추가합니다.시료를 얼음 위 암소에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 각 시료에 2 mL의 FACS buffer를 첨가하고, 4 °C에서 400 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 조심스럽게 제거하고, 세포를 300 µL의 FACS buffer에 재현탁한 후 볼텍싱합니다.그런 다음 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 분석해 감마 델타 T 세포의 기능을 평가합니다. 인터페론 감마 생산 능력은 세포 내 인터페론 감마 염색을 통해 분석합니다. 감마 델타 T 세포를 20 µg/mL의 felden A가 포함된 RPMI 10에서 2 × 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다.Felden A는 인터페론 감마의 분비를 억제하여 세포 내 인터페론 감마의 축적을 유발합니다. 다음으로, 100 µL의 RPMI 10만 포함하거나, 20 ng/mL의 four. Ball 12 ate 13 acetate와 2 µg/mL의 ion mycin 또는 Z duddy cells가 포함된 RPMI 10가 들어 있는 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 µL의 감마 델타 T 세포 현탁액을 옮깁니다.피펫팅을 여러 번 반복하여 혼합합니다. 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다. 그 후 4 °C에서 400 ×g로 5분간 원심분리하고, 펠릿을 200 µL의 차가운 PBS에 현탁시킵니다.샘플을 FACS 튜브로 옮깁니다. 그 다음 차가운 PBS 4 mL를 넣고 4 °C에서 400 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 5 µL의 FACS 버퍼가 포함된 50 µL의 FACS 버퍼로 펠렛을 재현탁합니다.FE 결합 anti TCRV gamma nine 및 2.5 µL PE SCI five 결합 anti CD three 단클론 항체를 빛이 차단된 상태에서 실온으로 15분 동안 배양합니다. 배양 후, intra prep reagent one 100 µL를 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 각 튜브에 PBS 4 mL를 첨가하고 실온에서 400 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 펠릿을 intra prep reagent two 100 µL에 재현탁하여 5분 동안 배양합니다.실온에서 PE 접합 항 인터페론 감마 단클론 항체 5 µL를 시험관에 넣습니다. 빛이 차단된 상태에서 15분 동안 배양합니다. 실온에서 각 튜브에 PBS 4 mL를 넣고 400 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 실온에서 흡입법으로 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 재현탁합니다.0.5 milliliters의 fax buffer에 담습니다. 유세포 분석기를 통해 세포를 분석하며, CD3 양성 및 TCR v gamma nine 양성 세포를 게이팅하여 interferon gamma의 발현을 조사합니다. 감마 델타 T 세포의 전형적인 표면 표현형이 여기에서 보여지는 바와 같이 나타납니다.0일 차에 CD3 및 TCRVγ9의 발현을 통해 감마 델타 T 세포를 식별하였습니다. PBMC 내 CD3 양성 TCRVγ9 양성 감마 델타 T 세포의 비율은 1.6%였습니다. 감마 델타 T 세포의 주요 집단은 CD27 양성, CD45RA 양성인 나이브(naive) 표현형 또는 CD27 양성, CD45RA 음성인 중앙 기억(central memory) 표현형이었습니다. CD27 및 CD45RA의 발현은 이들의 나이브 또는 기억 표현형을 결정하는 데 사용됩니다.CD 27 양성. CD 45 RA 양성은 나이브(naive) 상태입니다.CD 27 양성, CD 45 RA 음성은 중앙 기억 T 세포이며, CD 27 음성, CD 45 RA 양성은 effector memory T 세포입니다.RA 음성은 작동 기억 T 세포입니다. CD 27 음성. CD 45.RA 양성은 최종 분화된 표현형입니다. 세포의 활성화 상태는 여기에서 보여주는 바와 같이 NK G 2D 또는 CD 69로 분석되었습니다. Gamma delta T 세포는 NK G 2D를 발현하지만, CD 69는 발현하지 않습니다.14일간의 배양 후, gamma delta T 세포의 빈도는 배양된 세포의 93.8% 이상으로 증가했습니다. 성공적인 gamma delta T 세포 배양 시, 이들은 CD 27 음성 및 CD 45 RA 음성의 작동 기억 표현형을 나타냈습니다. 배양된 gamma delta T 세포는 nkg 2D 및 CD 69 발현을 상향 조절했습니다.세포 내 인터페론 감마 염색 결과, γδ T 세포는 PMA-CIN 처리 또는 IPP가 축적된 Z dwy 세포에 반응하여 인터페론 감마를 생성하는 것으로 나타났습니다. 졸레드로네이트 처리 후, γδ T 세포의 97%와 19.6%가 각각 PMA-CIN 및 Z ddy 세포 자극에 반응하여 인터페론 감마를 생성하였습니다. 이러한 결과는 졸레드로네이트가 기능적인 γδ T 세포를 효율적으로 자극하고 확장시킬 수 있음을 보여줍니다.zoledronate와 IL-2로 증식시킨 gamma delta T-세포 배양의 역학을 살펴보면, 배양 세포의 절대 수는 12~14일까지 기하급수적으로 증가하였습니다. gamma delta T-세포의 농축은 비교적 빠르게 이루어졌습니다. 배양 7일 차까지 배양 세포의 거의 80%가 gamma delta T-세포였습니다. 표시된 시점에서의 gamma delta T-세포 절대 수는 1.6 × 10⁴개의 gamma delta T-세포를 포함하는 1 × 10⁶개의 PPMC로부터 배양 후 약 2.2 × 10⁸개의 gamma delta T-세포를 얻을 수 있음을 보여줍니다.이 기술은 암 면역요법 분야의 연구자들이 다양한 종류의 암에서 임상 적용 가능성을 탐색할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 배양법은 암 환자를 대상으로 기증된 확장 gamma delta T-세포 전이 치료의 안전성과 타당성을 평가하는 1상 임상 시험에 사용되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Bryostatin의 1/Ionomycin에 의해 종양 반응 T 세포의 생체내 전 확장 및 일반 감마 체인 크린 시토킨 제제

여기 우리는 효율적으로 확장하고 정화 인간 NK 세포의 큰 숫자를하고 기능을 평가하는 방법을 설명합니다.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

전구세포의 파골세포로의 분화는 사이토카인과 성장인자에 의해 조절됩니다. 여기에서는 사이토카인이 파골세포형성에 미치는 영향을 연구하는 방법으로서 in vivo에서 파골세포를 파골세포로 분화하기 위한 새로운 유전자 전달 기술과 전구세포를 in vitro에서 파골세포로 분화하기 위한 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

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이식편 대 숙주 질병은 동종 골수 이식 후에 중요한 합병증입니다. 수지상 세포는 이식편 대 숙주 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 현재 논문은 이식편 대 숙주 질환및 이식편 대 백혈병 효과의 발달에 있는 수지상 세포의 역할을 조사하기 위하여 새로운 골수 이식 플랫폼을 기술합니다.

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

제시된 감마델타(γδ) T 세포 약품의 확장을 위한 프로토콜이다. 림프구는 졸레드로닉산 및 인터류신-2로 농축된 용류 및 γδ에 의해 분리된다. 알파 베타 T 세포는 임상 급 자기 분리 장치를 사용하여 고갈된다. γδ 세포는 K562 유래, 인공 항원 제시 세포와 공동 배양되고 확장된다.

감마 델타(γδ) T 세포의 확장 및 농축

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기능성 파골세포와 인간 말초 혈액 CD14+ 단핵구의 분화

여기서, 우리는 손상된 조혈 및 면역 체계의 재건을 위해 치료용 조혈 줄기세포/전구 세포를 수확하기 위해 뼈 형태 유전 단백질-2 로딩 젤라틴 골격에 의해 유발되는 생체 내 골 오가노이드를 확립했습니다. 전반적으로 이 접근법은 세포 치료를 위한 유망한 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

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Zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ T 세포

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