Drosophila Medulla 층과 기둥에 걸친 수지상 형태 분석

퇴

색 방지 마운팅 매체에 글리세롤로 제거된 초파리 뇌로 시작합니다.

뇌에는 시냅스 연결을 구성하는 층으로 배열된 수질 뉴런과 신경 회로를 조정하는 기둥이 있습니다.

이러한 뉴런 중 일부는 빨간색 형광 광수용체 축삭과 대조되는 녹색 형광 마커로 표지되어 있습니다.

뇌 복부를 위로 향하게 합니다. 뇌 샘플이 부서지는 것을 방지하기 위해 측면에 작은 점토 패치가 있는 커버슬립을 놓습니다.

현미경으로 녹색 라벨이 붙은 뉴런이 포함된 수평 보기 이미지 스택을 얻습니다.

커버슬립을 제거하고 뇌의 위치를 앞쪽이 위로 향하게 합니다.

동일한 뉴런의 정면도의 이미지 스택을 캡처합니다.

소프트웨어를 사용하여 이러한 이미지를 결합하고 광수용체 채널을 제거한 다음 뉴런의 3D 이미지를 시각화합니다.

축삭을 추적한 다음 수지상돌을 추적하여 각 가지를 따라 종단까지 추적하여 수질층과 기둥에 걸쳐 수지상 조직을 매핑합니다.

뇌를 수평 방향으로 장착하려면 글리세롤로 제거된 뇌를 현미경 슬라이드 중앙에 증착된 20마이크로리터의 퇴색 방지 마운팅 매체 방울로 옮깁니다. 그런 다음 커버슬립에 커버슬립이 뇌를 짓밟는 것을 방지하기 위해 네 모서리에 작은 점토 패치를 부착합니다.

이제 해부 현미경으로 뇌를 복부 위쪽 위치에 배치합니다. 뇌의 볼록한 등쪽 표면을 랜드마크로 사용하여 뇌 샘플의 방향을 식별합니다. 이것은 뉴런의 수평 보기를 제공합니다. 그런 다음 커버슬립을 부착합니다.

GaAsP 검출기가 이상적으로 장착된 공초점 현미경을 사용합니다. 높은 개구개 대물렌즈와 2.5의 디지털 줌으로 수평 보기 이미지 스택을 얻습니다. 최소 180개의 광학 섹션을 획득하고 512개의 정사각형 픽셀을 가지며 0.2미크론의 스텝 크기를 갖습니다.

첫 번째 이미지 스택을 촬영한 후 슬라이드에서 커버슬립을 제거하고 정면을 제공하는 전방 위 위치로 뇌를 재배치합니다. 그런 다음 동일한 기술을 사용하여 수평 보기에서 이미지화된 동일한 뉴런의 정면 보기의 새 이미지 스택을 만듭니다. 또한 수질 신경필과 관련하여 관심 있는 뉴런의 위치를 기록해야 합니다.

동일한 뉴런을 식별하는 것은 더 낮은 배율에서 가능합니다. 그러나 조직이 깊어서 신호가 손실되면 뇌의 복부 절반을 이미지화하십시오.

이 절차의 목표는 신경돌기를 추적하고 등록을 위한 기준점을 할당하는 것입니다. 먼저 재결합된 이미지 파일을 엽니다. 그런 다음 편집으로 이동한 다음 디스플레이 조정 표시로 이동하여 빨간색인 광수용체 채널을 끕니다