의식 억제 마우스에 인슈린 과다 - euglycemic 클램프

다음 실험의 전체적인 목표는 마우스에 스트레스를 주거나 직접 다루지 않고, 의식이 있는 상태에서 전신 및 조직 특이적 인슐린 작용을 평가하는 것입니다. 이를 위해 경정맥에는 주입용 카테터를, 경동맥에는 혈액 샘플 채취용 카테터를 외과적으로 삽입합니다. 5~7일간의 회복 기간을 거친 후, 5시간 동안 금식시킨 마우스에 인슐린을 주입하여 생리적 고인슐린혈증 상태를 유도합니다.

그 후 동맥 카테터를 통해 포도당 수치를 측정하며, 포도당 주입 속도를 조절하여 U glycemia를 유지합니다. 이 실험은 U glycemia를 유지하는 데 필요한 포도당 주입 속도와 인슐린 작용 사이의 직접적인 관계를 바탕으로 전신 인슐린 민감도의 차이를 측정할 수 있게 합니다. 꼬리 절단과 같은 기존의 혈액 채취 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 외과적으로 삽입된 동맥 카테터가 마우스에 대한 혈관 접근성을 제공하여 마우스를 직접 핸들링하지 않고도 혈액 샘플을 얻을 수 있다는 점입니다.

이를 통해 스트레스를 받지 않고 구속되지 않은 생쥐를 대상으로 실험을 수행할 수 있습니다. 동맥 카테터는 PE 10 튜브의 경사면 조각을 6 cm 길이의 astic 튜브에 삽입하여, PE 10이 셀로부터 0.9 cm 돌출되도록 제작합니다. 정맥 카테터는 칼라가 있는 6 cm 길이의 SEL 튜브입니다.

masa는 두 개의 1.3 cm 25 gauge 스테인리스 스틸 커넥터 각각에 3 cm 길이의 PE 20 조각을 삽입하여 약 120도 각도로 구성합니다. 이를 여기 보이는 것처럼 의료용 실리콘 접착제 덩어리에 삽입합니다. 카테터 삽입을 시작하려면, 멸균법을 사용하여 마취된 마우스를 깨끗한 작업 표면에 놓으십시오. 정중선에서 오른쪽으로 5 mm 지점에 절개창을 냅니다.

우측 경정맥을 분리합니다. 두부 쪽을 실크 봉합사로 조심스럽게 결찰하고, 꼬리 쪽 끝부분에 다른 봉합사를 느슨하게 묶습니다. 다음으로, 스프링 가위로 두부 결찰 부위 바로 아래를 절개한 뒤, 스토퍼 비드(restraining bead)가 닿을 때까지 카테터를 삽입합니다.

비드 뒤쪽으로 봉합사를 묶고, 카테터의 자유단을 샘플링 주사기에 연결하여 카테터의 샘플링 상태를 확인합니다. 동맥 카테터를 배치하려면 흉골에서 왼쪽으로 5 mm, 첫 번째 절개 부위보다 머리 쪽(cephalic)에 작은 절개를 가합니다. 좌측 총경동맥을 분리한 다음, 머리 쪽 부위를 결찰합니다.

실크 봉합사로 마무리하고 느슨하게 매듭을 짓습니다. 노출된 혈관의 근위단에 다른 봉합사를 배치합니다. 다음으로 혈관의 원위단을 클램프로 고정합니다.

스프링 가위로 결찰된 끝부분 바로 아래를 절단합니다. 클램프까지 카테터를 조심스럽게 삽입합니다. 클램프를 조심스럽게 풀고 카테터를 Astic P 접합부까지 전진시킵니다.

리게이처(ligature)를 카테터에 단단히 묶고, 카테터의 자유단을 샘플링 시린지에 연결하여 카테터의 샘플링 여부를 확인합니다. 다음으로 동물을 뒤집어 견갑골 사이에 작은 절개창을 내고, 앞쪽 절개창에서 뒤쪽 절개창까지 피부 아래로 14 gauge 바늘을 이용하여 터널을 만듭니다. 카테터를 바늘을 통해 통과시켜 생쥐의 등 쪽으로 외부로 노출시킵니다.

샘플링 접근 또는 masa를 위해 동맥 및 정맥 카테터를 마우스 안테나의 적절한 커넥터에 연결하십시오. 다음으로, 견갑골 사이의 절개 부위에 masa를 삽입하십시오. 나일론 봉합사로 두 절개 부위를 모두 봉합하십시오.

두 카테터의 개통성을 확인하십시오. 회복을 위해 마우스를 따뜻하고 깨끗한 케이지에 넣고, 인슐린 클램프를 수행하기 전 최소 5일 동안 회복 시간을 줍니다. 마우스에서 고인슐린혈증-정상혈당 클램프를 수행할 때 가장 어려운 단계는 정상혈당 상태를 유지하는 것입니다.

생쥐는 대사가 매우 빠르며 실험이 진행되는 동안 혈당 수치가 상당히 변할 수 있습니다. 따라서 실험 전반에 걸쳐 생쥐의 혈당 수치가 어떻게 변하는지 감을 익히고, 유글리세미아(U glycemia) 상태를 유지하기 위해 포도당 주입률을 조절하는 방법에는 어느 정도의 숙련이 필요합니다. 표준 클램프의 설정 방법이 여기에 나와 있습니다.

세 개의 infuse eight, 포도당, 인슐린 및 세척된 적혈구를 스위벨(swivel)에 연결된 4방향 커넥터에 부착하고 마우스 위에 매달아 둡니다. 스위벨의 주입구는 정맥 카테터에 연결합니다. 마우스를 연결하기 전에 모든 infuse eight 라인을 생리식염수로 채웁니다.

다음으로, 샘플링 라인을 헤파린 식염수로 채웁니다. 헤파린 식염수가 든 주사기를 스위블 상단에 연결한 상태로 두고 세척용 주사기를 제거합니다. 클램프 시작 5~6시간 전부터 마우스의 금식을 시작합니다.

단식 3시간 후에 마우스의 체중을 측정하고, 정맥 및 동맥 카테터를 각각 주입 라인과 샘플링 라인에 연결합니다. 클램프 시작 15분 전에 휴대용 혈당 측정기에 공 glucose drip을 삽입합니다. 그다음, 클리어링 시린지로 혈액 약 50 µL를 흡입하여 라인 내의 식염수를 제거한 후 클리어링 시린지를 분리합니다.

튜브 끝에 맺힌 혈액 방울에 혈당 측정지를 접촉시켜 혈당 수치를 측정합니다. 다음으로, 둔탁한 바늘(blunt needle)이 장착된 주사기를 샘플링 라인에 삽입하고 50 µL의 혈액을 채취합니다. 채취한 혈액을 EDTA 코팅 튜브에 분주하고 튜브를 원심 분리하여 기저 호르몬 및 대사산물 측정을 위한 혈장을 수집합니다.

이 시점에서 투명 시린지를 다시 삽입하고 플런저를 당깁니다. 기포를 제거하기 위해 처음에 채취했던 50 µL의 혈액을 다시 주입합니다. 혈당측정기로 측정된 혈당 수치를 기록합니다.

10분 후, 혈당계와 세척용 주사기를 사용하여 혈당 측정을 반복하고, 다시 50 µL의 혈액을 채취하여 또 다른 혈장 샘플을 얻습니다. 두 번째 기저치 측정이 완료되면 포도당, 인슐린 및 식염수로 세척된 적혈구용 주입 라인을 4방향 커넥터까지 채웁니다. 4방향 커넥터를 스위벨 주입 포트에 연결된 튜브에 연결합니다.

먼저 식염수로 세척한 적혈구를 주입합니다. 주입 속도는 연구 기간 동안 채취되는 전체 혈액량과 동일한 양이 대체되도록 설정하십시오. 적혈구 주입액이 마우스에 도달하면, 인슐린과 포도당 주입을 시작합니다.

지금은 0분 시점입니다. 인슐린을 미리 정해진 일정 속도로 주입합니다. 초기 포도당 주입 속도는 기저 혈당 수치와 이전의 경험을 바탕으로 추정합니다.

이후 2시간 동안 혈당계를 사용하여 혈당 수치를 측정하고, 목표 혈당 수치를 유지하도록 포도당 주입률을 조정합니다. 10분 간격으로 새로운 혈당 수치와 포도당 주입률을 기록하며, 100분과 120분 시점에는 혈장 인슐린 및 기타 호르몬 또는 대사물을 측정하기 위해 추가 혈액을 채취합니다. 여기에는 클램프 절차 전반에 걸친 혈당 수치의 시간적 경과가 나타나 있으며, 일반 식단 급여 쥐와 고지방 식단 급여 쥐 모두에서 클램프 기간 동안 혈당이 얼마나 잘 유지되었는지 보여줍니다. 포도당 주입률의 시간적 경과는 혈당을 유지하는 데 필요한 주입률이 고지방 식단 급여 군에서 유의하게 낮음을 보여주며, 이는 전신 인슐린 작용의 손상을 나타냅니다.

공복 및 클램프 인슐린 수치 또한 고지방 식이군에서 더 높게 나타났으며, 이는 인슐린 저항성 표현형의 존재를 더욱 뒷받침합니다. 이 마우스들에서 트리튬 표지 포도당은 내인성 포도당 출현 속도를 추정하는 데 사용됩니다. Endo A는 간 포도당 생성의 지표인 반면, 대조군 마우스에서는 인슐린이 Endo A를 완전히 억제합니다.

고지방 식이로 급여된 마우스에서는 억제 기능이 저하됩니다. 마찬가지로, 전신 포도당 소실률을 추정하기 위해 TRID glucose가 사용됩니다. 고지방 식이로 급여된 마우스에서는 Rd를 자극하는 인슐린의 능력이 손상됩니다.

탄소 14가 포함된 2-deoxy glucose는 조직 특이적 포도당 섭취의 척도인 포도당 대사 지수 RG를 평가하는 데 사용됩니다. 이 예시에서 볼 수 있듯이, 고지방 식이 식이요법을 수행한 생쥐에서는 인슐린에 의해 자극되는 골격근으로의 포도당 섭취가 저하됩니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 동맥 및 정맥 카테터 삽입에 필요한 미세 수술에 어려움을 겪을 수 있습니다.

해당 수술은 매우 전문적인 기술을 필요로 하며, 고인슐린혈증 유클라이세믹 클램프(hyperinsulinemic U glycemic clamp) 수술에 능숙해지기 위해서는 수개월 동안 지속적인 연습이 필요합니다. 여기서 다시 한번 어려운 점은 대사율이 매우 높은 동물 모델에서 유클라이세미아(U glycemia) 상태를 유지하려는 것입니다.