공초점 현미경 이미징을 사용한 수지상 가시의 정량화

형

질도입되고 면역표지되어 녹색 형광을 발하는 피라미드 뉴런을 취하십시오.

최적의 이미지 품질을 보장하기 위해 설정이 조정된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 뉴런의 이미지를 획득합니다.

특수 소프트웨어를 사용하여 이미지를 열고 가우스 필터를 사용하여 배경 소음을 줄입니다.

먼저 수상돌기 직경을 추정하여 반자동 수상돌기 추적을 수행합니다. 그런 다음 수상돌기의 시작점, 경로 및 끝점을 선택합니다.

자동화된 척추 분할의 경우 수상돌기 직경 재구축을 선택하고 실제 수상돌기 부피를 나타내도록 수상돌기 부피 임계값을 설정합니다.

가장 작은 스파인 헤드 지름과 최대 스파인 길이에 대한 값을 지정합니다.

척추를 나타내는 점의 임계값을 조정하여 실제 척추 머리에 위치화되도록 합니다.

매개변수를 설정하여 길이, 머리 직경 및 모양에 따라 척추를 분류합니다.

가시가 있는 수상돌기의 3D 모델을 생성하고 추가 분석을 위해 데이터를 내보냅니다.

공초점 현미경에서 피라미드 형태와 완전한 수지상 수목화가 있는 조건당 최소 10개의 건강한 뉴런을 선택합니다. 수지상당 60-100마이크로미터를 정량화하려면 40x, NA 1.3 오일 대물렌즈와 약 20마이크로와트의 샘플 수준에서 일반적인 피크 출력을 가진 488나노미터 레이저로 이미지를 획득합니다.

수지상 가시를 적절하게 샘플링하기 위해 픽셀 크기를 약 80나노미터로 설정합니다. 전체 뉴런 부피를 샘플링하려면 z 간격이 150 내지 300 나노미터인 Z 스택을 획득하여 20 내지 30 z 슬라이스를 산출합니다. 수지상 가시의 3D 정량화를 수행하려면 분석 소프트웨어에 대해 다음 설정을 사용하십시오.

전처리의 경우 이미지 처리, 스무딩, 가우스 필터를 선택하여 가우스 필터링을 사용합니다. 필터 너비를 XY 평면의 픽셀 크기와 동일하게 설정합니다. 수상돌기의 반자동 추적을 수행하려면 슬라이스 탭의 필라멘트 추적기 모듈에서 거리 도구를 사용하여 수상돌기 직경을 추정합니다.

그런 다음 Exceed 탭에서 필라멘트 도구를 클릭하고 더 나은 견고성을 위해 자동 생성 건너뛰기를 선택합니다. 이제 표시된 그리기 탭에서 방법으로 AutoPath를 선택하고 유형으로 Dendrite를 선택하고 예상 수상돌기 직경을 입력합니다. 포인터의 선택 모드를 사용하여 커서를 상자로 돌리고 Shift를 선택하고 수상돌기 시작점을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 소프트웨어가 초기 계산을 수행합니다.

이제 수상돌기를 따라 포인터를 이동합