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신경과학
0 조회수 • 2:35 분 • June 17th, 2025
배양 접시 내의 커버슬립에 마우스 1차 성상세포의 부착 배양으로 시작합니다.
온전한 세포막을 가로질러 성상세포로 들어가는 형광 산성향성 프로브와 함께 배양합니다.
프로브는 산성 엔도리소좀 소포 내부에 선택적으로 축적되고 소포를 형광으로 표지하여 수송을 모니터링합니다.
세척하여 여분의 프로브를 제거하고 신선한 배지를 추가합니다.
배양물을 공초점 현미경 아래에 놓고 단일 세포에 초점을 맞춰 타임랩스 이미징을 수행합니다.
표지된 화물을 핵주위 영역,
세포질 및 성상세포 과정
내에 분포된 형광 점점으로 시각화합니다.Z축을 따라 여러 초점면을 캡처하여 3차원 셀 부피 전체에 걸쳐 화물을 시각화합니다.
정의된 간격으로 이미징을 수행하여 성상세포 내의 다양한 깊이에서 세포내 화물 수송을 추적합니다.
화물의 움직임을 분석하여 정지 화물, 세포 주변으로 이동하는 화물, 핵을 향해 이동하는 화물을 구별합니다.
이미징 30분 전에, 적절한 리소좀 표지 프로브를 200마이크로리터의 성상세포 배양 배지에 1마이크로몰의 작동 농도로 희석하고 프로브로 성상세포를 섭씨 37도에서 30분 동안 표지합니다. 그런 다음 따뜻한 성상세포 배양 배지로 세포를 한 번 세척하고 세척액을 이미징 배지로 교체합니다.
프로브 라벨링 직후, 성상세포 배양 용기를 현미경 스테이지의 적절한 어댑터에 넣습니다. 그리고 epifluorescence 빛을 사용하여 형광 단백질 또는 프로브를 발현하는 세포를 찾습니다. 디지털 카메라를 사용하여 형광 샘플 조명을 조정하여 선택한 셀을 시각화하고 초점을 조정하고 단일 셀로 확대합니다.
그런 다음 줌 및 확정 초점 기능을 사용하여 300초에서 500초 사이의 시간 간격 동안 2초마다 한 프레임의 빈도로 단일 C-스택 타임랩스 시리즈를 획득합니다. 타임랩스 이미지를 Avi 또는 TIFF 스택 파일로 저장하고 내보냅니다.
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