마우스 뇌 절편에서 혈액-뇌 장벽의 고해상도 3차원 공초점 이미징

JoVE Encyclopedia of Experiments

신경과학

0 조회수 • 3:04 분 • June 18th, 2025

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컨포칼 현미경 소프트웨어로 시작하여 이미지 획득 매개변수를 설정합니다.

그런 다음 유리 슬라이드에 장착된 마우스 뇌 절편을 가져옵니다. 이 섹션은 혈액-뇌 장벽 성분을 표적으로 하는 항체로 염색됩니다.

혈액-뇌 장벽은 항상성을 유지하기 위해 혈류와 뇌 사이의 선택적 세포 인터페이스입니다.

원하는 굴절률을 가진 침지 오일 한 방울을 커버슬립에 바르면 해상도를 최적화하고 빛의 굴절을 최소화할 수 있습니다.

슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 epifluorescence 램프를 사용하여 샘플을 시각화합니다.

적절한 필터를 사용하여 DAPI 염색 핵을 찾고 이미징을 위해 모세관 세그먼트를 식별합니다.

라이브 스캔을 시작하고 각 형광 채널의 매개변수를 조정하여 고품질 이미지를 캡처합니다.

마지막으로 Z-스택 획득의 시작점과 끝점을 정의하여 혈액-뇌 장벽의 3차원 이미지를 생성합니다.

현미경을 제어하는 소프트웨어의 획득 메뉴에서 이미지 획득 매개변수를 설정합니다. 이미지 크기의 드롭다운 메뉴에서 1,024 x 1,024 픽셀의 값을 선택합니다. 확대/축소 메뉴의 값을 조정하여 픽셀 크기를 200에서 300나노미터 사이의 값으로 수정합니다.

획득 속도 드롭다운 메뉴에서 400Hz 값을 선택합니다. 그런 다음 시스템 설정 메뉴에서 픽셀 깊이를 선택하고 값을 12비트로 변경합니다. 그런 다음 현미경 소프트웨어의 획득 탭에서 순차 프레임 획득 옵션을 켭니다. Pinhole 메뉴에서 값을 수정하여 각 채널에 대해 광학 단면 두께를 0.75에서 1 마이크로미터 사이의 값으로 설정합니다.

커버슬립 위에 굴절률이 1.52인 침지 오일 한 방울을 추가하고, 유리 커버슬립과 대물렌즈의 굴절률과 일치하도록 뇌 섹션을 추가합니다. 그런 다음 샘플을 현미경에 넣고 낙광 형광등을 켜서 현미경 쌍안경을 사용하여 샘플을 시각화합니다. 그런 다음 버튼을 눌러 라이브 스캔 모드를 시작합니다. 스캔하는 동안 각 채널의 게인과 레이저 강도를 조정하여 이미지의 동적 범위를 최대화하고 픽셀 채도를 방지합니다. 그런 다음 모세관의 전체 부피에 걸쳐 광학 Z-스택을 수행하기 위한 시작 및 끝 섹션을 설정하고 0.45마이크로미터의 스텝 크기를 사용합니다.

중요한 것은 이미징 세션 동안 모든 획득 설정을 동일하게 유지해야 한다는 것입니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026