유충 제브라피쉬의 측면 선 유모 세포에서 칼슘 역학 이미징

관류실에 장착된 마비된 형질전환 제브라피쉬 유충을 예로 들어 보겠습니다.

유충은 물의 움직임을 감지하는 측면 라인 시스템의 구성 요소인 신경비대의 유모 세포에서 막 국소 칼슘 지표를 발현합니다.

유모 세포는 정점 모발 다발과 기저 시냅스 전 영역으로 구성되며, 이는 신호를 전달하기 위해 구심성 뉴런과 시냅스를 형성합니다.

공초점 현미경에서 낮은 배율을 사용하여 유체 제트 피펫을 유충 근처에 배치합니다..

배율을 높여 뉴로마스트를 찾고, 피펫을 그 근처에 재배치하고,

형광 이미징

으로 전환합니다.

유체 펄스를 전달하여 모발 다발을 편향시키고 칼슘 이온을 포함한 정점 양이온 유입을 위한 기계 형질도입 채널을 엽니다.

약한 형광 지표는 칼슘에 결합하여 형광의 국부적인 증가를 유발합니다.

양이온 유입은 세포를 탈분극시켜 기저 시냅스의 전압 개폐 채널을 통해 칼슘 진입을 유발하며, 여기서 지시약에 결합하고 국소적으로 형광을 증가시킵니다.

정점 및 기저 칼슘 역학을 실시간으로 시각화합니다.

이 절차에서는 겔 로딩 팁을 사용하여 10마이크로리터의 뉴런 완충액을 적절하게 파손된 유체 제트 바늘에 다시 채웁니다. 기포 없이 용액을 팁에 고르게 로드합니다. 그런 다음 전동 마이크로 매니퓰레이터에 부착된 피펫 홀더에 바늘을 삽입합니다.

관류 챔버를 현미경 스테이지의 원형 챔버 어댑터에 넣습니다. 유충이 시야의 중앙에 오도록 전동 스테이지를 이동합니다. 그런 다음 유충의 AP 축이 유체 제트 바늘의 궤적과 대략 정렬되도록 원형 챔버 어댑터를 돌립니다.

투과광과 미분 간섭 대비를 사용하여 유충에 초점을 맞추고 10배 대물렌즈 아래 중앙에 놓습니다. 그런 다음 10배 목표를 올리십시오. 전동 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 유체 제트 바늘을 시야 중앙으로 내려 투과된 빛에 의해 조명되고 신경 완충액에 거의 닿지 않도록 합니다.

유충의 위치를 확인하기 위해 유충에 초점을 맞추기 위해 10배 대물렌즈를 낮춥니다. 유체 제트 바늘에 대물렌즈를 집중시킵니다. 유충의 등쪽과 평행하게 위치할 때까지 x축과 y축에 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 유체 제트 바늘을 움직입니다.

그런 다음 유충에 다시 집중하십시오. 바늘을 z축으로 내리고 몸에서 1mm 떨어진 물고기의 등쪽을 따라 바늘을 놓습니다. 원형 챔버 어댑터를 조심스럽게 움직여 유체 제트 바늘이 유충의 AP 정중선을 따라 정렬되도록 합니다.

그런 다음 60배 물 대물렌즈로 전환합니다. 대물렌즈가 뉴런 버퍼에 잠겨 있는지