파킨슨병의 일방적-6-OHDA lesioned 마우스 모델의 개발

이 절차의 전반적인 목적은 파킨슨병 마우스 모델을 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수술에 필요한 약물을 준비합니다. 다음 단계로 수술 장치를 설정한 후, 적절한 수술 후 관리와 함께 일측성 6-hydroxy dopamine 병변 수술을 수행합니다.

6마리의 6-hydroxy dopamine으로 병변을 유도한 동물들을 행동 실험에 사용할 수 있습니다. 결과적으로, 외측 단측의 내측 전뇌 다발에서 95% 이상의 도파민 고갈이 나타납니다. 이 절차에서 연구자가 가장 주의 깊게 살펴봐야 할 두 가지 핵심 사항 중 첫 번째는 동물의 생존을 보장하기 위한 적절한 수술 후 관리입니다.

둘째로, 6-hydroxy dopamine의 주입을 위한 장비 준비 과정에 주의하여 신경독소가 완전히 전달되도록 합니다. 이 절차를 시작하려면, 고압 증기 멸균기로 수술 도구를 멸균하십시오. 다음으로, 모든 표면과 장비를 이소프로필 알코올로 세척하십시오.

그런 다음 바닥에 종이 타월을 깐 마우스 회복용 케이지를 준비하여 수술 후 조치를 대비하십시오. 마취 트롤리를 설정하기 위해 케이지를 가열 램프 아래나 가열 패드 위에 놓으십시오. 산소 유입구가 연결되어 열려 있는지, 그리고 isof fluorine 저장조가 완전히 채워져 있는지 확인하십시오.

그 후, 산소 유량을 1%로, 이소플루린을 2~4%로 설정합니다. 다음 단계는 주입 장치를 조립하는 것입니다. 피크 튜브의 한쪽 끝에 RN 금속 너트 하나를 끼우고, 이어서 피크 컵 페룰을 끼웁니다. 그다음 표준 PFA 페룰을 끼웁니다. 표준 PFA 페룰의 원뿔 부분이 피크 컵 페룰의 결합 부위에 맞게 들어가도록 페룰의 방향을 맞춥니다.

그 다음, 결합된 피크 컵(peak cup)과 표준 PFA 페룰(ferral)을 듀얼 소형 허브 RN 커플러의 양 끝단 중 한 곳에 배치하고, 듀얼 소형 허브 RN 커플러의 반대쪽 끝에 있는 RN 금속 너트를 조입니다. 33 gauge 주사 바늘을 삽입합니다. RN 금속 너트 중 하나를 통해 바늘을 통과시킨 후 조입니다.

33 gauge 바늘이 이중 소형 허브 RN 커플러와 180도 각도를 이루는지 확인하십시오. 그런 다음 peak 튜빙의 다른 쪽 끝에 RN 금속 너트를 끼우고 이어서 peak 컵 페룰을 끼웁니다. 그다음 정준 PFA 페룰을 두 번째 이중 소형 허브 RN 커플러의 더 깊은 홈에 끼우고 RN 금속 너트를 조여 연결을 고정하십시오.

다음으로, 두 번째 소형 듀얼 RN 허브 커플러의 반대쪽 끝에 루어를 소형 허브 RN 어댑터에 삽입하고, 루어의 RN 금속 너트를 조여 연결을 고정합니다. 이제 주입 장치의 설치가 완료되었습니다. 또 다른 준비 단계는 주입 장치를 프라이밍하는 것입니다.

먼저, 250 µL 및 1 µL Hamilton 시린지를 멸균수로 채웁니다. 이때 기포가 없는지 확인하십시오. 그 다음 250 µL 시린지를 루어 어댑터에 연결하고, 250 µL 시린지의 플런저를 눌러 튜브 반대편 끝에 있는 33 gauge 주사 바늘을 통해 물이 배출되도록 합니다.

250 µL 시린지를 루어 어댑터에서 빼내면서 시스템을 통해 계속해서 물을 밀어내십시오. 루어 어댑터 끝에 작은 물방울이 맺혀 있도록 둔 상태에서, 1 µL 시린지의 플런저를 눌러 작은 물방울이 배출되게 합니다. 그다음 1 µL 시린지를 루어 어댑터에 조심스럽게 삽입하십시오.

1 µL 주사기의 물 방울이 루어 어댑터의 물 방울과 연결되었는지 확인하십시오. 그다음 1 µL 주사기를 루어 어댑터에 완전히 삽입하고, 소형 듀얼 RN 허브 커플러 내부에 기포가 없는지 확인하십시오. 이제 관류 장치를 정위 고정틀에 고정한 후, 인퓨전 펌프 클램프를 사용하여 33 gauge 주사 바늘이 연결된 소형 듀얼 RN 허브 커플러를 정위 고정틀의 매니퓰레이터 암에 고정하십시오.

그런 다음 1 µL 시린지를 관류 펌프에 고정합니다. 그 후, 수술 30분 전에 주입 펌프를 설정하여 0.1 µL/min의 주입 속도로 주입되도록 합니다. 동물의 무게를 측정하고 기록합니다.

마우스에 2.5 mg/mL의 dopamine hydrochloride와 0.5 mg/mL의 parline hydrochloride 혼합액을 kg당 10 mL의 용량으로 복강 내 투여합니다. 그다음, 수술 중 동물의 체온을 유지하기 위해 이어 바(ear bar)와 절치 바(incisor bar) 아래에 따뜻한 가열 디스크를 배치하고, 고정틀의 이어 바와 절치 바에 맞게 동물을 적절한 높이로 유지합니다. dopamine hydrochloride와 parline hydrochloride 혼합액 투여 후 15분이 지나면 고정틀을 설치합니다.

마우스를 폐쇄된 발작 챔버에 넣습니다. 이소플루레인(isoflurane) 흡입을 통해 동물을 마취합니다. 뒷다리 꼬집기에 반응이 없고 눈깜빡임 반사가 나타나지 않으면 동물이 충분히 마취된 것입니다.

그런 다음 마우스의 머리 윗부분을 삭모합니다. 이제 마우스를 정위 고정기(stereotaxic frame)에 배치합니다. 절치 바를 입에 물리고 안면 마스크를 얼굴에 씌웁니다.

그 후 이소플루란의 유량을 조절합니다. 솜을 사용하여 국소 마취제인 리도카인을 피부에 직접 도포합니다. 절치 바(incisor bar)와 이어 컵(ear cups)을 조절하여 두개골 상단을 수평으로 맞춥니다.

그 다음 Betadine 용액으로 피부를 소독합니다. 이어서 이어 컵(ear cups)을 삽입합니다. 머리가 완전히 평평해지고 어느 방향으로도 움직이지 않을 때 이어 컵이 올바르게 삽입된 것입니다.

그 후, 메스 날을 사용하여 머리의 정중선을 따라 절개하고 피부를 젖힙니다. 거즈 패드로 두개골 표면의 수분을 제거합니다. 1 µL 주사기의 플런저를 누른 다음, 33 gauge 주사 바늘을 15 mg/mL 농도의 1 mL 튜브에 넣습니다.

알루미늄 호일로 덮인 6-hydroxy dopamine 용액. 33 gauge 주입 바늘을 6-hydroxy dopamine 용액에 담근 상태에서 플런저를 천천히 뒤로 당깁니다. 다음으로, 주입 바늘의 팁을 B bgma 쪽으로 이동시켜 6-hydroxy dopamine 용액을 소량 분사하여 작은 방울을 형성합니다.

그런 다음 주입 바늘 팁을 천천히 내립니다. 비드가 bgma에 닿으면 바늘 전진을 멈추고 이 좌표를 기록합니다. 주입 바늘을 등쪽 방향으로 2mm 후퇴시킨 후, 람다(Lambda)를 향해 시상 봉합선을 따라 rostral coddle 방향으로 이동합니다.

Lambda의 상단에 위치했을 때, 주사 바늘에서 소량의 six hydroxy dopamine 용액을 분사하여 작은 방울을 형성합니다. 그런 다음 바늘 끝을 lambda 방향으로 천천히 내립니다. 방울이 Lambda에 닿으면 바늘 전진을 멈추고 해당 좌표를 기록합니다.

BMA와 Lambda의 내측-외측 및 등측-복측 좌표는 동일해야 합니다. 만약 동일하지 않다면, 그에 맞게 절치 바(incisor bar)를 조정하십시오. 전후 좌표와 내측-외측 좌표를 위한 이어 바(ear bar)의 경우, 바늘을 주입 좌표로 이동시키십시오.

AP -1.2 mm, ML -1.1 mm의 상대적 좌표에서, 작은 방울을 형성하기 위해 주입 바늘로부터 소량의 용액을 분사합니다. 이 작은 방울을 두개골 위에 내려놓아 구멍을 뚫을 위치를 표시합니다. 그런 다음 바늘을 빼고, 25 gauge 바늘을 사용하여 두개골에 구멍을 뚫습니다.

주입 바늘을 주입 좌표로 되돌린 후, 등-배측(dorsal ventral) 방향을 따라 -5 mm까지 바늘을 삽입합니다. 다음으로, 6-hydroxy dopamine 또는 vehicle 0.2 µL를 분당 0.1 µL의 속도로 내측 전뇌다발(median forebrain bundle)에 일측성으로 주입합니다. 6-hydroxy dopamine 또는 vehicle 투여가 완료되면, 주입 부위에서 확산이 일어날 수 있도록 바늘을 5분 동안 더 그대로 둡니다.

그 후, 바늘을 천천히 뽑고 세 바늘의 봉합사로 두피의 절개 부위를 봉합한 다음, 1 mL의 젖산 링거액(lactated ringer solution)을 피하 주사합니다. 마지막으로, 동물을 정위 고정 장치에서 분리하여 의식을 회복할 때까지 회복용 케이지에 둡니다. 6-하이드록시도파민(six hydroxy dopamine) 병변 수술 후 15~21일이 경과한 시점입니다.

신경독소로 인한 세포 사멸이 완료되면, 6-hydroxy dopamine 병변 유도의 성공 여부를 평가하기 위해 자발적인 360도 회전 횟수를 측정할 수 있습니다. 이 행동 평가에서, 6-hydroxy dopamine으로 인해 도파민 결핍이 95% 이상 유도된 마우스는 6-hydroxy dopamine을 부분적으로 처리했거나 가짜 수술(sham operation)을 받은 마우스보다 유의하게 더 많은 IP subversive rotation을 보입니다. 각 개체의 SAL 도파민 수치와 자발적 IP subversive rotation의 백분율을 상관 분석함으로써, 6-hydroxy dopamine 병변 후 IP subversive rotation이 70% 이상 나타난 마우스는 Sal 도파민의 95% 이상이 소실된 것으로 확인되었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 마우스에서 정위 고정 및 확산 제어 방식으로 6-hydroxy dopamine 병변을 효과적으로 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이를 통해 95% 이상의 도파민 고갈 수준을 달성할 수 있습니다. 또한, 마우스에서 파킨슨병의 행동 평가를 수행하는 방법도 이해하게 될 것입니다.