결합된 공초점 현미경과 초고해상도 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부의 특성화

JoVE Encyclopedia of Experiments

신경과학

0 조회수 • 4:07 분 • June 17th, 2025

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멀티웰 플레이트의 웰에 넣은 화학적으로 고정되고 투과화된 쥐 근육 섬유로 시작합니다.

비특이적 항체 결합을 최소화하기 위해 차단 용액에서 배양합니다.

신경근 접합부 또는 NMJ에서 발현되는 시냅스 전 단백질을 표적으로 하는 1차 항체를 추가합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

1차 항체를 표적으로 하는 형광단 접합 2차 항체 및 시냅스 후 아세틸콜린 수용체에 결합하는 형광단 접합 신경독과 함께 배양합니다.

결합되지 않은 시약을 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

장착 매체가 있는 슬라이드에 섬유를 놓고 커버슬립을 배치한 다음 원통형 자석으로 고정하여 섬유를 평평하게 만듭니다.

공초점 STED 현미경을 사용하여 이미징을 시작합니다.

레이저 조명에 따라 표지된 단백질은 형광을 발합니다.

공초점 현미경은 제한된 해상도와 형광 확산으로 인해 더 미세한 NMJ 구조를 선명하게 분해하지 못합니다.

대조적으로, STED 현미경은 공핍 레이저를 사용하여 형광 확산을 억제하여 선명한 NMJ 시각화를 가능하게 합니다.

안락사 후 두 개의 미세한 톱니 모양 겸자를 사용하여 약 1mm 너비의 작은 섬유 다발로 경골근 전방 근육을 놀리기 시작합니다. 그런 다음 이 근육 다발을 PBS에서 준비된 1% Triton X-100이 포함된 24웰 플레이트로 옮기고 실온에서 1시간 또는 섭씨 4도에서 5시간 동안 부드럽게 교반합니다.

실온에서 PBS로 5분 동안 샘플을 3회 세척한 후, 1% Triton X-100과 함께 PBS에서 제조된 4% BSA로 구성된 차단 용액과 함께 샘플을 섭씨 4도에서 부드럽게 교반하면서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 뉴로필라멘트 M 또는 시냅스 소포 당단백질 2에 대한 1차 단클론 항체를 포함하는 동일한 차단 용액과 함께 샘플을 밤새 배양하여 시냅스 전 축삭 말단 또는 활성 영역을 각각 표지합니다.

다음날, 표지된 근육 다발을 PBS로 5분 동안 세 번 세척하여 부드럽게 교반합니다. 그런 다음 실온에서 2시간 동안 셰이커에 올려 적절한 2차 항체와 함께 배양합니다. 근육 다발을 다시 세척한 후 마운팅 매체가 있는 슬라이드 위에 놓습니다. 그런 다음 상단에 1.5등급 유리 커버슬립을 놓고 슬라이드 양쪽에 원통형 자석을 놓아 압력을 가하고 근육을 평평하게 만듭니다.

공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득하려면 현미경 소프트웨어를 실행하고 구성 모드로 기계를 선택한 다음 텍스트 원고에 언급된 설정에 따라 각 실험 그룹의 신경근 접합부의 이미지 스택을 수집합니다. 세션이 끝나면 3D 뷰어에서 열기를 클릭하고 실험 그룹을 대표하는 신경근 접합부를 선택하여 3D 라벨링을 시각화합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026