Name: 세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 배우세요 혈류 전단 응력이 세균의 숙주 세포 부착에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 유동 챔버와 형광 미세경을 사용하여 Neisseria meningitidis의 감염 메커니즘을 실시간으로 관찰하고 정량 분석할 수 있습니다.

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저자는 프로 시저의 최대 초기 설정 에밀 Mairey과 임마누엘 Donnadieu 감사하고 싶습니다.

1. 인간 숙주 세포 및 세균 문화 <ol><li> 통과 1 5 % (V / V) CO 2 humidified 인큐베이터에서 37 ° 9 사이의 문화 HUVECs. 통로 세포들은 일회용 흐름 챔버 (μ - 슬라이드 VI)에서 75cm 두 문화 flasks 및 실험 문화 정비 문화를 제공하는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 80 % 합류 접근시. </li><li> passaged 수 flasks에서 매체를 철회, PBS의 10 ML로 세포를 씻어 철회하고 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1.5 ML로 바꾸십시오. 세포 ° C. 37 5 분 인큐베이터 세포 배양에서 분리하도록 허용 </li><li> 15 ML 수집 튜브에 세포 배양 매체 10 ML있는 세포를 수집합니다. 상온에서 5 분 원심 분리와 펠렛은 전지 (200g에서). 10 % 보충 엔도 - SFM 4 ML에있는 세포를 일시 중지 (V / V) FBS와 제조 업체의 지시에 따라, Malassez 챔버 그들을 계산합니다. </li><li> 채널 (3x10 4 개)로 ML 정지 당 1x10 6 HUVEC 세포의 30 μl를 소개하고 세포를 37에서 3 시간 준수 ° humidified 인큐베이터에 5 % (V / V) CO 2의 분위기 수 있습니다. 우물을 채우기 위해 엔도 - SFM 120 μl의 추가 볼륨을 추가합니다. 세포는 subconfluent monolayer (그림 2)을 형성한다. </li><li> N. 그로 켈로그의 보조제 37에서 5 μg / chloramphenicol의 ML ° 5 %를 포함한 습한 분위기에서 C (V /를 포함하는 GCB 한천 플레이트에 GFP를 (IPTG - inducible 프로 모터의 제어하에이 경우에는 스트레인 8,013 표현 GFP), 표현 meningitidis V) 16 시간 동안 CO 2. </li></ol> 2. 개인 박테리아의 초기 접착력은 세포를 호스트 <ol><li> 사전 예열 엔도 - SFM은 37 120분 10 % (V / V) FBS와 부화를 포함한 ° C를 5 % (V /를 포함한 습한 분위기와 0.05의 OD600에 GCB의 한천 플레이트에 성장 박테리아의 농도를 조절 V) 부드러운 흔들림 (130 RPM)에서 CO 2. 전체 배양 기간 동안 문화 매체에 1 ㎜의 IPTG를 추가하여 GFP 발현을 유도. </li><li> 37 샘플 온도를 유지하기 위해 가열 플랫폼 ° C. 갖춘 거꾸로 현미경의 무대에서 μ - 슬라이드 일회용을 플레이스 </li><li> 멸균 유리 비커에 2%과 보완 사전 예열 엔도 - SFM (V / V) FBS를 붓고이 매체와 살균 50 ML의 주사기를 입력하십시오. 주사기로 "항목"튜브를 부착하고 매체를 도입하여 기입하십시오. </li><li> 챔버에 공기를 도입하지 않도록하기 위해,주의, μ - 슬라이드에있는 "항목"튜빙을 연결합니다. 그런 다음, 신중하게 접사 다른 끝에 "종료"튜브 및 챔버 '출구'에서 약 1cm 거리에 매체와 채널을 입력합니다. </li><li> 박테리아 OD600를 측정하고 엔도 - SFM 2 % (V / V) FBS를 포함하는으로 0.15을 조절할 수 있습니다. 개인 박테리아를 봐하기 위해서는 모든 집계는 세균 샘플의 활발한 vortexing에 의해 중단될 수 있어야합니다. </li><li> 엔도 - SFM 장소 100 μl의 저수지 2 개의 % (V / V) FBS 배지로 보충하고 나머지 박테리아 합산을 샘플링하지 않도록 vortexed 솔루션의 정상에서 찍은 세균성 솔루션을 100 μl를 추가합니다. </li><li> 챔버에 박테리아를 주입하기 위해 꼭지를 돌려하여 μ - 슬라이드에 200 μl 볼륨을 조심스럽게을 소개합니다. </li><li> 2 %가 포함된 엔도 - SFM (V / V) 37 유지 FBS, 각하 온수 플랫폼과 C, 0.044 다인즈 / 15 분 cm 2의 접착력과 호환 전단 응력과 주사기 펌프를 사용하여 챔버에. 소개 </li></ol> 동영상 1 또는 그림 3 예를 들어 참조하십시오. 이 단계 후에, 각 섹션 3, 4 또는 6로 이동합니다. 3. 호스트 세포 개별 박테리아의 초기 접착의 부량 <ol><li> 액체가 계속 순환되는 동안 15 분 동안 초기 접착 후, 무작위로 열 필드의 이미지를 획득. </li><li> 분야마다 adherant 박테리아의 수를 의미에 액세스하려면 ImageJ 소프트웨어 8, 사용하여 얻은 이미지를 분석합니다. 다음과 같이이 이루어집니다 : 우선, 각각의 이미지가 세포의 배경을 최소화하면서, 각각의 준수 형광 박테리아를 강조하는 '이미지'메뉴에있는 "임계값"창을 사용 thresholded 있습니다. 그런 다음, 모든 단일 세균이 플러그인 "셀 카운터"(사용하여 계산됩니다 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html를</a> .) 각 이미지에 대한 데이터는 Excel 스프레드 시트에서보고 있으며, 분야마다 자기편 박테리아의 평균 개수를 정할 평균입니다. </li></ol> 4. 호스트 세포에 점착 성의 개별 박테리아의 흐름에 저항을 측정 <ol><li> 프로그램 주사기 펌프 3 백 다인즈 / 5 분 cm 2까지 전단 응력을 생성 - 설정합니다. </li><li> 5 분 끝에, 단계 3.1에서 설명한대로 무작위로 선택한 열 필드를 취득하지만, 흐름과 PR을 중지인수 ior. </li><li> 로 단계 3.2에서 설명한 획득한 이미지를 분석하고 현장마다 남아있는 박테리아의 의미 번호를 계량. </li></ol> 5. microcolony에 절연 점착 성의 박테리아의 성장을 측정 <ol><li> 엔도 - SFM 10 % (V / V) 37 유지 FBS, 각하 온수 플랫폼과 C, 몇 시간 동안 선택한 전단 응력과 주사기 펌프를 사용하여 챔버에.를 포함하는 소개 한 프레임마다 5 분 실시간 비디오 현미경에 대한 기록 이미지. </li><li> 비디오 현미경 다음, 주사기 펌프를 해제하여 전단 응력을 중단, 2-3 추가 영상을 얻은 후 소프트웨어에서 이미지 수집 순서를 중지합니다. 박테리아 확산의 예제는 비디오 2 볼 수 있습니다. </li></ol> 6. 자기편 세균성 microcolonies의 흐름에 저항을 측정 <ol><li> 세포 표면에 큰 microcolonies의 형성 후 (step5.2) 흐름을 신청하기 전에 2-3 두 세포의 이미지 (상 대조적으로)와 박테리아를 (GFP - 형광에 의해) 취득. 실험의 나머지 부분은 인수 프로토콜은 형광을 모니터링합니다. </li><li> 한 프레임 5 초마다에서 5 분 (3-100 다인즈 / cm 2) 및 기록 이미지에 대한 높은 전단 응력을 적용. </li><li> 주사기 펌프를 해제하여 전단 응력를 중지, 2-3 추가 영상을 얻은 후 소프트웨어에서 이미지 수집 순서를 중지합니다. </li><li> 다음 먼저 "종료"튜브를 제거하고 신중하게, 채널을 비우는 피하기 위해 다음 "항목"튜브를 제거하기 전에 우물을 채우기 위해 미리 예열 신선한 매체를 추가하십시오. </li><li> 양적 세균성 저항에 대한 전단 응력의 효과를 확인하려면, 도금 분석은 다음과 같이 수행할 수 있습니다 : 남아있는 매체를 수집하고 채널 (모두 세척이에서 남아있는 매체를 제거 PBS 120 μl와 두 번 μ - 슬라이드 씻어 또한 수집된). </li><li> 37 °에서 5 분간 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 50 μl를 추가로 감염된 세포를 분리하고 이전 단계에서 수집된 현탁액이 분리된 샘플을 섞는다. </li><li> PBS 및 플레이트 세중의에 GCB의 한천 플레이트에 10 μl 분수에서 시리얼 dilutions, 37에서 접시의 부화 후 다음날 콜로니 형성 단위의 수 (CFU)를 결정하기 위해를 수행 ° 인큐베이터에서 C와 함께 5 % (V / V) CO 2. </li></ol> 비디오 3 4 pilV 돌연변과 야생 타입 응력을 비교합니다. 7. microcolonies에서 세균 분리 <ol><li> 2.8 단계 2.1 반복하여 흐름 챔버에 세포를 감염과 감염이 30 분 동안 진행하실 수 있습니다. </li><li> 2 분 동안 10 다인즈 / cm 2 흐름을 증가하여 언바운드 박테리아를 제거하고 감염이 2 시간을 위해 계속하실 수 있습니다. </li><li> 0.15 다인즈 / cm 2 흐름을 줄입니다. </li><li> 모든 시간의 흐름 챔버 나오는 매체의 드롭를 수집합니다. </li><li> GCB의 한천 플레이트에 샘플을 판 그들의 시리얼 dilutions을 수행합니다. </li><li> 37 접시의 부화 후 다음날 콜로니 형성 단위의 수 (CFU), 각하 인큐베이터에서 C 5 % (V / V) CO 2를 결정합니다. </li></ol> 8. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 관찰과 절차의 흐름의 면전에서 측정할 수있는 세포 monolayer의 다른 단계를 반복합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 실험 (전단 응력의 ​​부재)의 시작 부분에 흐름 챔버에서 내피 세포 monolayer. 약 50 내피 세포는 서브 합류 monolayer로 구성됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 세포 표면에 박테리아의 초기 접착력의 그래픽 표현. 세 분야에 대한 값 (0044 다인즈 / cm 2) 예상되는 분야 - 투 - 현장 변화의 아이디어를주는 표시됩니다. 비디오 1. 시간 함수 (0044 다인즈 / cm 2)로 세포 monolayer에 대한 박테리아의 초기 접착력의 시각화. GFP - 표현 박테리아는 흐르는 매체의 방향을 따르고 있습니다. 이 영화는 60 배 가속은, 비디오의 실제 소요 시간은 10 분입니다. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 비디오 2. 초기 부착 세균 후는 7 시간의 기간 (1000 배 가속)에 대한 세포 표면에 세포 분열 따위에 의해 번식 수있게되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 비디오 3. 확산 후 세포 표면에 기계공microcolonies의 알 저항이 있지만 야생 유형 microcolonies가 내성을 가속 60 배 아르 5 분 10 다인즈 / cm 2로 전단 응력 수준을 증가하여 테스트되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a> pilV 돌연변이에 의해 형성 비디오 4. Microcolonies는 흐름 증가 (10 다인즈 / cm 2)에 의해 방해하고 있습니다. 이 돌연변이가 microcolonies 아래 플라즈마 막의 리모델링을 유도하는 데 실패하고 증가 전단 응력 (동영상 60 배 가속입니다) 5함으로써 더 높은 민감합니다. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

전단 응력과 일반적으로 생물의 기계 부분의 중요성이 점차 인식되고있다. 예를 들어 lymphocytes 부착 및 혈관 벽에 압연 과정에서 단백질의 Selectin 가족의 고도의 적응 접착제 속성이 과정에서 전단 응력을 도입하여 인정되었습니다. 위에서 설명한 절차는 그람 음성 세균 Neisseria meningitidis의 적용했지만 병원균의 광범위한 적용해야합니다. 전단 응력의 중요성은 다른 병원균 및 기타 감염 사이트에도 게재되었습니다. 전단 응력에 의해 에어컨 세균 유착이 uropathogenic 대장균 (UPEC) 9에있는 FimH adhesin의 연구에 의해 설명되었다. Selectins 마찬가지로, FimH 및 숙주 세포 수용체 간의 상호 작용이 전단 유도된 기계적 힘에 9 enterotoxigenic E.coli의 CfaE adhesin에 의해 강화하는 게재된는 전단에 의존 통해 창자 상피 세포에 부착을 중재하는 것도보고되었습니다 메커니즘 10. 우리는 연쇄상 구균 agalactiae 필리는 유동 조건 하에서 상피 세포가 11이 병원체의 준수에 필수적인 것을이 장에서 설명한 층류 흐름 챔버 분석 프로토콜을 사용했다. 이러한 연구는 우리의 흐름 챔버 분석은 전단 응력의 조건 호스트 병원체 상호 작용 세포를 조사하는 유용한 도구입니다 있는지 확인합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> μ - 슬라이드 VI 0.4 흐름 키트 </td><td> IBIDI </td><td> 80,606 </td></tr><tr><td> 주사기 Plastipak 50 ML Luer - 잠금 </td><td> 백톤 디킨슨 </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon 튜빙 R3603 3.2 X 4.8mm </td><td> 피셔 - 과학 </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> 남성 luer 3 방향 꼭지, 2 여성 luer </td><td> 바이오 래드 </td><td> 7,328,103 </td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 하버드 장치 </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> 거꾸로 현미경, 니콘 </td><td> 니콘 </td><td> 이클립스 T I </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> 하마 마츠 </td><td> 오르카 285 CCD 또는 오르카 3 - CCD </td></tr><tr><td> ImageJ 소프트웨어 </td><td> NIH </td><td> 프리웨어 ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 감염 동안 상호 작용의 순서는 병원체와 숙주 사이에 발생합니다. 숙주 세포의 표면에 세균 부착이 자주 pathogenesis의 초기 및 결정 단계입니다. 실험적으로 유착이 거의 정적 조건에서 공부 있지만 접착력은 실제로 액체를 흐르는 앞에서 열립니다. 세균과 호스트 간의 첫 번째 조우는 종종 점액은 상피 세포의 표면을 따라 흐르는 점막 레벨, 입, 폐, 뱃속, 눈, 등에서 발생합니다. 나중 감염에 병원균은 종종 같은 패혈증, 패혈증과 뇌막염과 같​​은 생명을 위협하는 질병의 원인이 혈액 순환을 액세스할 수 있습니다. 이러한 감염의 정의 기능은 혈액을 순환의 존재에있는 내피 세포와 상호 작용 이러한 병원균의 능력입니다. 그것은 병원체에 기계적 힘을 생성하기 때문에 액체, 점액 또는 인스턴스에 대한 혈액을 흐르는 존재는 접착력을 결정합니다. 액체를 흐르는 효과를 특징 짓는하기 위해서는 일반적으로 다인즈 / cm 2의 표현 고정 벽 근처에 움직이는 유체에 의해 단위 면적 당 끼쳤다 접선 힘이 전단 응력의 ​​개념을 말합니다. 전단 응력의 ​​농도가 다른 선박의 종류에 따라 다양, 크기, 장기, 위치 등 (0-100 다인즈 / cm 2). 모세 혈관의 순환은 매우 낮은 전단 응력 값에 도달 심지어 일시적으로 몇 분 1 몇 초 사이에 이르는 기간 동안 중단할 수 있습니다. arterioles의 스펙트럼 전단 응력의 ​​다른 쪽 끝을에 100 다인즈 / cm 2 2에 도달할 수 있습니다. 다른 생물 학적 과정에 대한 전단 응력의 ​​영향은 명확하게 내피 3 leukocytes의 상호 작용하는 동안 인스턴스로 증명되었습니다. 계정에 세균 유착 과정에서이 기계 매개 변수를 이용하려면 우리는 일회용 흐름의 사용 챔버 4 기반의 실험 절차를 이용했다. 호스트 세포가 흐름 챔버 재배하고 형광 박테리아는 주사기 펌프에 의해 제어 흐름에서 소개하고 있습니다. 우리는 처음 세균성 병원체 Neisseria meningitidis, 패혈증과 뇌막염에 대한 책임 그람 음성 세균에 대한 조사를 하였다. 절차는 우리가 박테리아의 능력에 전단 응력의 ​​영향을 연구 허용 여기서 설명 : 세포 표면 5 분아 따위에 의해 번식하는 세포 1을 준수하고 새로운 사이트를 6 (그림 1)을 식민지로 분리합니다. 보완 기술 정보 참조 7 찾을 수 있습니다. 여기에 제시 전단 응력 값은 문헌에서 찾을 값을 나타내는 우리의 이전 경험을 1에 따라 선정되었습니다. 프로토콜은 연구의 목표에 따라 구체적인 조정과 병원균의 광범위한 적용해야합니다.

감염 과정에서 핵심적인 단계는 호스트 세포로 병원균의 접착합니다. 대부분의 경우에서는이 유착 단계는 액체를 흐르는 의해 생성된 기계적 응력의 존재에 발생합니다. 우리는 세균 유착의 연구에 중요한 매개 변수로 전단 응력을 소개하는 기술을 설명합니다.

세균 감염 과정 동안 병원체와 숙주 사이에는 일련의 상호작용이 일어납니다. 숙주 세포 표면에 대한 세균의 부착은 종종 ...

이 영상은 세균 부착에 미치는 전단 응력의 영향을 연구하는 절차를 보여줍니다. Neisseria meningitidis와 같은 세균성 병원균에 의한 심각한 감염 과정에서, 병원균은 혈류에 도달하여 혈류로 인한 기계적 응력을 받는 상태에서 숙주 세포에 부착하고 군락을 형성합니다. 증식 후 일부 세균은 떨어져 나와 새로운 부위에 군락을 형성하며 이 주기(cycle)가 반복됩니다. 숙주 세포에 대한 세균 부착에 영향을 미치는 요인을 연구하기 위해, 일회용 유동 챔버(flow chamber)에 혈관 내피세포를 도입하고 세포가 합쳐질 때까지 배양합니다.형광 박테리아를 첨가하고 전단 응력을 실험적으로 제어합니다. 시린지 펌프를 사용하여 박테리아의 숙주 세포 부착 및 증식을 현미경으로 관찰합니다. 결과 영상을 분석하여 전단 응력이 혈관 내피 세포의 군집 형성 과정에 미치는 영향을 결정합니다.이 절차는 수막구균성 뇌수막염의 병인 연구에 매우 유용할 수 있으며, 병인 과정 전반에 걸쳐 전단 응력을 받는 다른 박테리아 연구에도 활용될 수 있습니다. 이 기술은 특히 시스템 내에 기포가 유입될 때 문제가 발생할 수 있어 다소 까다로울 수 있습니다. 따라서 오늘은 저희 실험실의 박사 과정 학생인 Mega가 이 절차를 시연하겠습니다.본 영상에서 설명하는 실험은 IDI 마이크로 슬라이드 식스 0.4를 사용하여 배양된 세포로 수행됩니다. 이 슬라이드는 길이가 17mm, 너비가 3.8mm, 깊이가 0.4mm인 6개의 채널이 포함된 일회용 멸균 플라스틱 슬라이드입니다. 각 채널의 양 끝에는 uve 세포를 주입할 수 있는 루어 어댑터가 장착된 두 개의 액세스 포트가 있습니다. 각 채널에 1 × 10⁶ 세포 현탁액 30µL를 피펫으로 분주합니다. 슬라이드 위에서 세포가 37°C, 5% CO₂ 분위기의 가습 인큐베이터 내에서 3시간 동안 부착되도록 둡니다.배양 후, endo SFM 120마이크로리터를 추가로 첨가하십시오. 웰을 채우기 위해 세포들은 약 20시간 후에 하합류 단층(sub confluent monolayer)을 형성해야 합니다. 그동안 GFP를 발현하는 *Neisseria meningitidis*를 APL 상에 도말하십시오. 해당 박테리아는 인간 병원균입니다.따라서, 이 미생물을 다루는 모든 조작은 가운과 장갑을 착용한 숙련된 인원이 있는 2단계 생물 안전 시설에서 수행되어야 하며, 사용되는 혈청 그룹에 대해 인원들의 백신 접종이 권장됩니다. 여기 GFP를 발현하는 8 0 1 3 균주가 있으며, 이는 IPDG 유도성 프로모터의 제어 하에 배양되어 스트리킹됩니다.Kellogg 보충제와 5 µg/mL의 chloramphenicol이 포함된 GC BPL에서 박테리아를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터 내에서 16시간 동안 배양합니다. 포유류 세포 배양이 완료되면, 채널 내의 숙주 세포에 박테리아를 첨가합니다. 유량 분석(flow assay)을 준비하기 위해, 접종 루프를 사용하여 페트리 접시에서 박테리아를 수집하고, 이를 미리 데워둔 보충제 함유 혈관 내피 세포 배양액이 들어 있는 50 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.Endo SFM 배지를 사용합니다. 샘플을 동일한 배지로 희석하여 최종 부피를 5 mL로 맞춘 후, 광학 밀도를 OD 600 기준 0.05로 조정합니다. GFP 발현을 유도하기 위해 IPTG를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하고, 배양액을 120분 동안 배양합니다.습도가 유지되는 37°C, 5% CO2 배양기에서 완만하게 흔들어 줍니다. 미리 준비한 내피세포가 배양된 마이크로 슬라이드를 시료 온도를 37°C로 유지할 수 있도록 가열 플랫폼이 장착된 도립 현미경의 스테이지 위에 놓습니다. 2% FBS가 첨가되어 미리 데워진 endo SFM을 멸균 유리 비커에 붓고, 플런저를 당겨 50 mL 시린지를 채웁니다.입입 튜브는 3방향 스톱콕(three-way stop cock)에 연결되어 있습니다. 다음으로, 입입 튜브를 시린지에 연결하고 플런저를 눌러 튜브 내부를 배지로 채웁니다. 제공된 직각 커넥터를 사용하여 입입 튜브의 반대쪽 끝을 마이크로 슬라이드에 조심스럽게 연결합니다.챔버 내에 공기가 유입되지 않도록 주의하십시오. 펌프에 시린지를 장착한 후, 스톱콕의 빈 슬롯에 절단된 1mL 시린지를 저장조로 배치하십시오. 그런 다음 채널의 반대쪽 끝에 배출 튜브를 부착하고, 시린지 플런저를 밀어 배지(medium)가 챔버 출구로부터 약 1cm 거리까지 채워지도록 조심스럽게 주입하십시오.박테리아의 OD 600을 측정하고, 이전과 같이 2% FBS가 함유된 endo SFM을 사용하여 0.15로 조정하며, 박테리아 응집체를 분산시키기 위해 샘플을 격렬하게 볼텍싱합니다. 다음으로, 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 2% FBS가 첨가된 endos fm 배지 100 µL를 리저버로 옮깁니다. 그런 다음 볼텍싱 중인 용액의 상층부에서 박테리아 용액 100 µL를 흡입하여 리저버에 추가합니다.스톱콕을 조심스럽게 돌려 박테리아를 마이크로 슬라이드 챔버에 주입하여 조절된 전단 응력 수준 하에서 부착이 진행되도록 합니다. 시린지 펌프를 사용하여 2% FBS가 포함된 endo SFM을 시간당 3.5 milliliters의 속도로 15분 동안 챔버에 주입합니다. 이 영상은 60배속으로 빠르게 재생되었습니다.실제 소요 시간은 10분입니다. 이 단계 이후에는 비디오의 다음 섹션에서 설명하는 바와 같이, 다양한 조건에서 박테리아의 숙주 세포 부착 및 분리 상태를 평가할 수 있습니다. 개별 박테리아의 숙주 세포 초기 부착 정도를 정량화하려면, 액체가 계속 순환하는 상태에서 유동 시작 15분 후에 이미지 획득을 시작하십시오. 무작위로 10개 영역의 이미지를 획득하여 촬영된 영역당 평균 부착 박테리아 수를 결정합니다.ImageJ 소프트웨어를 실행하고 분석할 이미지를 엽니다. 이미지 메뉴를 클릭한 후 'Adjust brightness contrast'를 선택하여 시작하십시오.커서를 이동시켜 강도 레벨을 조정함으로써 배경 대비 개별적으로 부착된 형광 박테리아의 시각화를 최적화하십시오. 그 다음, 플러그인의 analyze cell counter 메뉴를 선택하십시오. cell counter 도구를 열어 이미지를 초기화하고, 객체 유형(object type)을 선택한 뒤 개별 박테리아를 각각 클릭하십시오.윈도우에 총 박테리아 수가 나타납니다. 마지막으로, 각 이미지의 데이터를 엑셀로 내보낸 뒤 평균을 내어 시야당 부착된 박테리아의 평균 수를 정량화함으로써, 개별 부착 박테리아의 흐름에 대한 저항성을 측정합니다. 초기 15분간의 흐름 프로그램 후, 시린지 펌프를 설정하여 5분 동안 제곱센티미터당 3에서 100 dyne 범위의 전단 응력을 생성합니다.5분이 지나면 흐름을 멈추고, 이전과 동일하게 10개의 임의 영역을 획득 및 분석하여 영역당 잔류 박테리아의 평균 수를 결정합니다. 초기 15분간의 흐름 이후, 시린지 펌프를 선택한 전단 응력으로 조정합니다. 5분마다 한 프레임씩 이미지를 기록하며 수 시간 동안 흐르게 합니다.현미경에 전동 XY 스테이지가 장착되어 있다면, 이상적으로 여러 위치를 추적할 수 있습니다. 비디오 현미경 관찰 후, 시린지 펌프를 꺼서 전단 응력을 중단하십시오. 즉시 2~3장의 이미지를 추가로 획득한 다음, 소프트웨어에서 이미지 획득 시퀀스를 중지하십시오.박테리아 증식의 예시를 여기에서 확인할 수 있습니다. 마지막으로, 이미지를 분석하려면 Image J의 'Image Adjust Threshold' 메뉴를 사용하여 이미지를 이진화하십시오. 그런 다음 'Analyze' 메뉴의 'Set Measurements'에서 면적 측정(area measurement)을 선택하십시오.그 다음, 입자 분석(analyze particle) 도구를 사용하여 콜로니의 크기를 자동으로 측정합니다. 이 시점에서 흐름 유지 여부와 관계없이, 5~7시간 후에 세포 표면에 커다란 마이크로 콜로니가 형성됩니다. 먼저 흐름에 대한 마이크로 콜로니의 저항성을 측정하기 위해, 위상차 현미경으로 세포를, GFP 형광으로 박테리아를 각각 2~3장의 이미지로 획득하십시오.5분 동안 높은 전단 응력을 가하고, 5초마다 한 프레임씩 형광 이미지를 촬영합니다. 시린지 펌프를 꺼서 전단 응력을 중단합니다. 2~3장의 이미지를 추가로 획득한 후, 도말 분석을 위한 배지를 수집하기 위해 소프트웨어에서 이미지 획득 시퀀스를 중단합니다.먼저, 채널이 비워지지 않도록 주의하면서 배출 튜브를 제거합니다. 미리 데워둔 신선한 배지를 추가하여 웰을 채웁니다. 그런 다음 유입 튜브를 제거하고, 마이크로 피펫으로 남은 배지를 수집하여 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 채널에 남아 있는 배지를 모두 제거하기 위해, 채널에 PBS 120 µL를 두 번 추가하여 마이크로 슬라이드를 헹굽니다.슬라이드를 두 번 기울여 배지를 제거합니다. 감염된 세포를 수집하기 위해, 마이크로 슬라이드에 50 µL의 tripsin EDTA를 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양하여 채널에서 세포를 분리한 후, 분리된 샘플을 이전 단계에서 수집한 현탁액과 혼합합니다. PBS로 단계 희석을 수행한 후, 10 µL 분량을 GCB agri 플레이트에 도말하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 3회 반복 배양합니다.다음 날, 마이크로 콜로니로부터의 박테리아 탈착을 평가하기 위해 콜로니 형성 단위 수를 측정합니다. 이전과 같이 유동 챔버 내의 세포를 3.5 mL/h의 낮은 유속으로 감염시키고, 30분 후 유속을 5 mL/min으로 2분 동안 높여 결합하지 않은 박테리아를 제거한 다음, 다시 3.5 mL/h의 낮은 유속으로 되돌려 2시간 동안 감염을 지속합니다. 그 후 4시간 동안 매시간 유동 챔버에서 배출되는 배지 한 방울을 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.모든 샘플의 수집이 완료되면, 이전과 동일하게 콜로니 형성 단위(colony forming units)의 수를 측정합니다. 이는 세포 표면에 박테리아가 초기에 부착된 정도를 그래프로 나타낸 것입니다. 그래프의 각 선은 시간에 따른 특정 시야 내에 결합된 박테리아의 누적 수를 나타냅니다.세 가지 필드의 값을 통해 세포 표면에서 증식 후 예상되는 필드 간 변동성을 보여줍니다. 마이크로 콜로니의 기계적 저항성은 전단 응력 수준을 10 dines per square centimeter까지 높여 테스트하였으며, 야생형 마이크로 콜로니는 저항성을 보이는 반면 pill v 돌연변이에 의해 형성된 마이크로 콜로니는 유량 증가에 의해 파괴됩니다. 이 돌연변이는 마이크로 콜로니 하부의 형질막 리모델링을 유도하지 못하며, 따라서 발달 후 증가된 전단 응력에 더 민감하게 반응합니다.이 기술은 감염병 분야의 다른 연구자들이 전단 응력이 다양한 병원균과 여러 세포 유형 간의 상호작용에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 인간 병원균을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 2단계 또는 3단계 수준의 주의 조치와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Ditkowski, B. 외 박테리아가 이식 조직에 부착하는 현상을 연구하기 위한 평행판 관류 시스템의 in vitro 모델. J. Vis. 경험 (2019).이 영상은 평행판 유동 챔버를 이용해 형광 표지된 박테리아를 혈관 이식 조직 위에 관류하는 방법을 시연하여, 전단 흐름 조건에서 박테리아 부착과 초기 병태 기전을 통제하여 분석할 수 있게 합니다.

조직 생검에서 박테리아 부착을 연구하기 위한 in vitro 평행판 유동 모델

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

전단 응력을 받는 혈관과 박테리아의 상호 작용을 연구하기 위해 혈관 접착에 기여하는 박테리아 및 숙주 요인을 해부할 수 있는 유동 챔버 및 생체 내 장간막 생체 내 현미경 모델이 설명됩니다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

숙주 세포에 대한 박테리아 부착은 숙주 집락화 및 감염 과정에서 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 폴리머 결합 재조합 애착체의 생성을 생체 모방 물질로 설명하며, 이를 통해 다른 박테리아 요인과 독립적으로 이러한 과정에 대한 개별 애착체의 기여도를 분석할 수 있습니다.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

이들은 기계적 장력 송신 조직 항상성 및 개발에 관여하는 신호 전달 경로를 시작으로 세포 표면 유착은 mechanotransduction 중앙이다. 여기서는 리간드 피복 된 자성 마이크로 비드 접착 수용체 포스 응용 프로그램을 사용하여, 인장에 응답하여 활성화되는 생화학 적 경로를 해부위한 프로토콜을 제시한다.

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

우리는 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석 결과 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향 조사에 대 한 개발 했습니다. 이 분석 결과 cytometry, immunostaining, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법, 양적 측정 셀, 그들의 기질, 및 병원 성 박테리아 사이 biomechanical 상호 작용의 수와 호환 됩니다.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

여기, 우리 악기를 포함 한 녹색 형광 단백질을 표현 하는 녹 농 균 biofilms에 전단 응력 효과의 분석을 위한 형광 현미경과 함께 더 높은 처리량 미세 생물의 사용 설명 설정, biofilm 범위, 성장 율, 및 형태학 속성의 결정.

라이브 셀 분석의 전단 응력에 녹 농 균 등 처리량 미세 자동 시스템을 사용 하 여

이 방법은 세포 부착의 초기 역학을 정량화하고 앵커리지 의존적 세포를 섬유넥틴상으로 확산시키는 데 유용하다. 더욱이, 이 분석은 세포 확산 및/또는 세포 부착 관련 세포 내 신호 경로에 변경된 산화배 항상성의 효력을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

배우세요 혈류 전단 응력이 세균의 숙주 세포 부착에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 유동 챔버와 형광 미세경을 사용하여 Neisseria meningitidis의 감염 메커니즘을 실시간으로 관찰하고 정량 분석할 수 있습니다.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

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