생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

본 절차는 ran 및 반딧불이 루시페라제(firefly luciferase)를 시각화하고 정량화합니다. in vivo 정위성 종양을 개발하기 위해서는 ran vanilla 또는 반딧불이 루시페라제, 혹은 두 가지 모두를 발현하는 안정적 세포주를 먼저 구축하십시오. 그 다음, 안정적으로 발현된 리포터 구조체의 in vitro 조절 능력을 기능적으로 검증하십시오.

다음 단계는 세포를 유선 지방 패드(mammary fat pad)에 이식하고 ran 및 반딧불이 루시페라제(firefly luciferase) 측정값을 모두 획득하여 정량화하는 것입니다. 면역 조직 화학 염색과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 종양의 진행과 전이 과정 중 생체 내(in vivo) 유전자 조절을 종단적이고 역동적으로 관찰할 수 있다는 점입니다. 먼저 바닐라 루시페라제(vanilla luciferase)를 인코딩하는 발현 벡터가 포함된 T one 기억 암세포 배양물을 4개로 분할하는 것부터 시작하십시오.

최적화된 항생제 농도 하에서 며칠 동안 형질전환을 수행합니다. 그런 다음 ran vanilla luciferase를 발현하는 단일 콜로니 약 10개를 선택하여 발현 정도를 모니터링합니다. ran vanilla luciferase를 다량으로 발현하는 콜로니를 계속 증폭하여 기능 분석을 진행합니다.

안정적인 바닐라 발현(vanilla expression) 선택에 사용된 것과 다른 선택 마커를 보유한 PGL four luciferase 리포터 플라스미드에 관심 프로모터 영역을 서브클로닝하고, 악성 세포에 형질전환한 후 96-well 플레이트에서 전통적인 인비트로(in vitro) 세포 기반 루시퍼레이즈 리포터 유전자 분석법을 사용하여 반딧불이 루시퍼레이즈(firefly luciferase)의 안정적인 다클론 집단을 선택합니다. DBR 세포가 일시적으로 형질전환된 모세포에서 관찰된 것과 일치하는 방식으로 반딧불이 루시퍼레이즈 발현을 조절하는지 확인합니다. 이 벡터들이 포함된 세포를 궤도 쉐이커(orbital shaker)에 15분 동안 두어 세포를 용해합니다.

또한 vanilla의 CMV 유도 발현이 다양한 세포 자극이나 처리 조건에 의해 조절되지 않는지 확인하십시오. 예정된 날의 전날에 공형광률(co fluency)이 낮은 DBR 전이성 four one memory 암세포를 증식시키십시오. 생체 내 접종 단계에서는, 접종을 위해 trypsin으로 four one 세포를 해리하십시오.

성장 배지로 충분히 세척한 후 즉시 PBS로 세포를 희석하십시오. 얼음 위에 보관하십시오. 4~6주 된 암컷 bowel C 마우스를 isof fluorine으로 마취시켰습니다.

포셉을 사용하여 네 번째 서혜부 메모리 패드를 부드럽게 잡고 들어 올립니다. 27.5 gauge 바늘의 사면(bevel)이 위를 향하도록 조심스럽게 배치하고, 유두 바로 아래의 메모리 지방 패드에 주입합니다.

바늘이 복강 내로 들어가지 않도록 특별히 주의합니다. 조직을 놓아주고 마우스가 여전히 마취 상태인 동안 기억 지방 패드(memory fat pad)에 세포 현탁액 50 µL를 천천히 주입합니다. 꼬리 측면 정맥에 red eject cine 100 µL를 주입합니다.

마우스를 즉시 IVUS 200 이미징 시스템에 넣고 1분 동안 발광 이미지를 획득합니다. 마우스를 다시 케이지로 옮겨 약 1시간 동안 대기하며, 이를 통해 잔류하는 ran vanilla Lucifer 신호가 모두 사라지도록 합니다. 이제 IP 주입을 통해 D Lucifer potassium salt를 투여한 후, 5분 뒤에 isof fluorine을 사용하여 마우스를 마취합니다.

기존 RAN vanilla 이미지 획득 시와 동일한 위치에서 IVIS 200으로 이동합니다. IVIS living image 소프트웨어를 광자(photons) 모드로 설정합니다. firefly 및 광자 획득 모두에 대한 값을 설정합니다.

매우 공격적인 41 세포는 일주일 이내에 촉진 가능한 종양을 형성합니다. 따라서 매주 쥐에 red eject cine을 주입하여 전반적인 종양 성장과 전이를 모니터링하십시오. 그다음 d Lucifer를 주입하여 종양 발달의 다양한 단계 동안 경로 특이적 신호 전달을 모니터링하십시오.

종양 세포 접종 시의 첫 측정값을 기준으로 RAN 루시페레이스 획득값을 정규화하여 원발성 종양의 성장을 추적하십시오. 더 중요한 것은, 시간에 따른 RLR 값을 계산하여 종양의 성장 및 진행과 관련하여 개별 신호 전달 체계의 시간적 조절을 확립하는 것입니다. 이제, 원발성 종양에 대해 계산된 값과 폐의 RLR 값을 비교하여 종양의 성장 및 전이와 관련한 개별 신호 전달 체계의 공간적 조절을 확립하십시오.

이중 생물 발광 이미징은 원발성 종양 내의 세포 구성 변화를 시각화하고 추적하는 데 사용됩니다. 먼저, vanilla luciferase를 발현하는 4T1 세포와 비전이성 및 동계인 firefly luciferase 발현 4T07 세포를 혼합한 다음, 앞서 설명한 바와 같이 이 혼합 유방암 세포 집단을 다양한 비율로 유선 지방 패드에 주입합니다. 주입된 세포 혼합물에 대한 초기 RS를 설정하기 위해 즉시 firefly luciferase와 vanilla luciferase 이미지를 모두 획득합니다.

원발성 종양 내의 세포 구성을 묘사하기 위해 종단적 이중 생물 발광 이미지를 지속적으로 획득합니다. 또한 종양의 성장 및 진행과 관련하여 각 유방암 유도체의 시공간적 전이를 평가합니다. 각 이미지는 내부적으로 일관되고 제어되므로, 원발성 종양에서 나오는 지속적인 신호는 각 vanilla 및 firefly 데이터 획득의 전반적인 후속 실패를 측정하는 중요한 지표가 됩니다.

루시닌 기질은 산화에 매우 민감하여 자가 발광을 유발합니다. 여기서, 루시닌의 정맥 주입(IV injection)이 실패하면 확립된 원발성 종양이 아닌 위장관에서 비특이적 신호가 발생합니다. 41 원발성 종양 및 폐 전이를 가진 마우스의 성공적인 신장 획득 사례에서는 반딧불이 루시페라아제(firefly luciferase) 영상을 통해 경로 특이적 신호 측정을 도출할 수 있습니다.

이 데이터들을 통해 원발성 종양과 폐 전이암 모두에서 RS를 계산할 수 있습니다. 이 실험을 마친 후, 면역조직화학염색 및 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)과 같은 다른 기술을 사용하여 mRNA와 단백질의 결과가 보고된 컨스트럭트와 유사한 방식으로 조절되는지 확인할 수 있습니다.