의 야생 - 타입과 장식 품종을 구별하기 PCR 기반 Genotyping 방법 Imperata cylindrica

이 절차의 주요 목적은 형태학만으로는 구별할 수 없는 일반적으로 곤그라스(gon grass)라고 하는 Retta cylindrica의 품종을 구별할 수 있는 비용 효율적이고 신속한 분자 유전형 분석 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 관심 있는 곤 그래스 품종에서 조직을 식별하고 분리함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 수집된 조직에서 핵 및 석고 DNA를 추출하는 것입니다.

다음으로 PLAs turn LF 영역의 염기서열 차이를 표적으로 하는 다양한 특이적 프라이머와 적절한 positive 및 negative control을 사용하여 추출된 DNA에 대해 중합효소 연쇄 반응을 수행합니다. 마지막 단계는 4개의 PCR 반응 각각에 대해 겔 전기영동을 수행하여 증폭된 PCR 산물을 시각화하는 것입니다. 궁극적으로, 수집된 곤 그라스의 다양성은 젤 침습적 계획에 대한 특정 PCR 제품 금지로 인해 미국은 연간 약 34억 달러의 비용을 지출하여 농업 자원과 천연 자원 모두에 상당한 피해를 입힙니다.

Cogan이라고도 알려진 야생형 imparato Electrica, 잔디는 세계에서 가장 나쁜 10대 침입성 잡초 중 하나입니다. 코간 그래스는 토착 식물을 대체하는 모노 스탠드에서 빠르게 확산되며, 그 토착 식물 GaN 잔디에 의존하는 동물은 현재 전 세계적으로 4 억 9 천만 헥타르와 미국에서 약 500, 000 헥타르를 감염시키고 tus centrica의 ti의 관상용 품종은 tus Centrica라는 이름으로 널리 판매되고 있습니다. Arbra, red Baren, 그리고 JBG라고 부르는 Japanese blood crass. 이 품종은 불임이며 비 침습성으로 추정되며 붉은 색의 잎으로 인해 바람직한 것으로 간주됩니다.

특정 조건에서 일본 블러드 그래스는 생존 가능한 씨앗을 생산하고 야생형 코간 풀과 구별할 수 없는 완전한 녹색 형태로 돌아갈 수 있습니다. 보시다시피, 그들은 둘 다 녹색 잎을 가지고 있으며 더 큰 잎을 가진 전통적인 관상용 품종보다 큽니다. 또한, 회귀 및 야생형 식물은 뿌리 줄기가 더 크고 관상용 품종은 무성 생식 잠재력을 증가시킵니다.

회귀는 형태학만을 통해 식별을 수행합니다. 힘든 작업입니다. 분자 방법은 일반적인 시각적 수단으로는 식별할 수 없는 침입 식물과 식물 물질을 정확하게 구별할 수 있는 수단을 제공합니다.

분자 방법은 침입 식물의 확산 및 유입을 방지하는 데 중요합니다. 이 분자 프로토콜의 적용은 일본 블러드 그래스 회귀와 코간 그래스를 정확하게 구별할 수 있는 수단을 제공합니다. 이 프로토콜은 Kogan grass와의 동시 발생 및 실행 가능한 잡종의 형성 가능성을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.

증폭 단편 길이 다형성 또는 FLP 분석 및 DNA 염기서열 분석과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 야생형 코간 풀과 일본 블러드 그래스 품종의 차이를 쉽게 구별할 수 있는 매우 비용 효율적이고 빠른 분자 유전형 분석 기술을 제공한다는 것입니다. 이 기술을 시연하는 사람은 우리 연구실의 학부생인 Joseph Hery입니다. 먼저 곤풀(gon grass) 또는 일본 블러드 그래스(Japanese blood grass)가 자라고 있고 서로 구별해야 하는 사이트에서 표본을 식별합니다.

일본블러드그래스는 밝은 붉은색 잎으로 야생형 곤풀과 쉽게 구별됩니다. 그러나 일본 블러드 그래스 되돌리기는 관상용 일본 블러드 그래스보다 녹색 잎이 길고 잎 면적이 더 많으며 뿌리 줄기가 더 크기 때문에 Kogan 잔디와 거의 구별 할 수 없습니다. 이 방법은 신선하거나 냉동된 잎 조직, 최근에 건조된 잎 조직에 사용할 수 있습니다.

나중에 DNA 추출을 위해 조직을 보관하는 경우 가장 좋은 방법은 조직을 즉시 영하 80도에서 동결하고 보관하는 것입니다. 건조 보관이 필요한 경우 티슈를 종이 봉투에 넣고 실온에서 탈수된 실리카겔 또는 기타 활성 건조제에 봉투를 보관하십시오. 새로운 조직을 사용하는 경우 분해를 방지하기 위해 채취 후 3시간 이내에 DNA를 추출해야 합니다.

이 절차는 제조업체의 지침에 따라 한 가지 사소한 수정으로 Kyogen의 DNEZ 식물 미니 키트를 사용합니다. 여기. 이 절차는 100mg 이상의 신선 또는 냉동 조직 또는 20mg 이상의 건조 조직이 사용되도록 조정되었습니다. 먼저 100mg 이상의 신선하거나 냉동된 잎 조직 또는 20mg 이상의 건조 잎 조직을 식힌 절구와 유봉에서 분쇄하여 액체 질소를 3회 사용하여 미세한 분말로 분쇄합니다.

신선 또는 냉동 조직의 냉동 분말을 100mg 분취량으로 계량합니다. 마른 잎 조직을 사용하는 경우 분말의 무게를 20mg 분취량으로 나눕니다. 이 단계 후, NanoDrop 분광 광도계 테스트와 같은 분광 광도계를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출을 진행하고, DNA, 품질 및 수량이 양호한 DNA 수율은 마이크로 리터 당 50 및 150 나노 그램 사이이어야하며, 2 개의 80 및 2 32 80 비율은 2.0에 가깝습니다. 여기.

표준 1%AROS 겔을 사용하여 전기영동을 수행합니다. DNA 농도가 높은 경우 RNA 오염으로 인한 줄무늬가 거의 없이 10KB보다 큰 비교적 큰 띠의 존재를 확인하고 후속 단계를 위해 샘플을 마이크로리터당 70나노그램으로 희석합니다. 이 프로토콜에 사용된 PCR 프라이머는 빨간색과 녹색 화살표로 표시되며, Cogan grass의 석고 회전 LF 스페이서 영역과 일본 blood grass 유전자형 간의 서열 차이를 기반으로 합니다.

이러한 차이는 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism)과 수직 검은색 화살표로 표시된 삽입 및 결실의 형태로 나타나며, 이를 통해 다양한 특이적 프라이머를 개발할 수 있습니다. 유일한 순서의 위치에 뇌관을 찾아서, 뇌관 순서는 쓰여진 의정서에 따라 각 뇌관 세트를 사용하여 얼음에 0.2 밀리리터 얇은 벽 PCR 관에 있는 2개의 50 마이크로리터 PCR 반응을 설치한 각 고립된 DNA 견본을 위한 의정서의 쓰여진 부분에 포함됩니다. DNA 농도가 낮으면 총 반응 부피가 50마이크로리터로 유지되도록 뉴클레아제가 없는 이중 증류수의 양을 조정하면서 각 반응에 더 많은 DNA를 추가할 수 있습니다.

DNA 샘플에 포함된 불순물이 PCR 반응을 억제하여 모든 PCR 시약이 작동하고 양성 대조군이 잘 설정되도록 할 수 있으므로 5마이크로리터 이상의 DNA 또는 반응당 총 부피의 10%를 사용하지 마십시오. 양성 대조군 프라이머를 사용하여 양성 대조군과 동일한 대조군 프라이머 세트를 사용하여 음성 대조군을 설정하지만, 이 시점에서 추출된 DNA 대신 이중 증류수를 사용하여 테스트 중인 각 샘플에 대해 총 4개의 PCR 반응이 있습니다. 다음으로, DNA 프라이머 압정 중합효소의 품질 또는 사용된 thermocycler의 유형에 따라 프라임 무릎 꿇기 온도, 확장 시간 및 사이클 수에 대한 서면 프로토콜 최적화의 PCR 사이클링 매개변수를 사용하여 가열된 뚜껑이 장착된 thermocycler에서 PCR 증폭을 수행합니다.

PCR 반응이 완료되면 표준 전기영동을 사용하여 1%gel에서 PCR 산물을 분리합니다. D 프론트가 겔 전체 길이의 3/4에 도달할 때까지 약 120볼트에서 샘플을 실행합니다. UV 광선 아래에서 겔을 시각화하고 결과 밴드를 검사하여 적절한 DNA 단편이 증폭되었는지 확인합니다.

본 대표적인 겔은 Kogan grass, Japanese blood grass 및 Japanese blood grass revert DNA 샘플과 Kogan grass 및 JBG specific primer를 결합한 PCR 제품의 전기영동 결과와 turn LF positive control 및 no template negative control을 보여준다. 턴 LF 포지티브 컨트롤 프라이머 세트는 코건 그래스, 일본 블러드 그래스, 일본 블러드 그래스 되돌리기 및 기타 잔디에 똑같이 잘 작동하며 890 베이스 페어의 밴드를 생성합니다. 모든 PCR 시약에 DNA 오염 물질이 없는 경우 음성 대조 반응으로 PCR 산물이 생성되지 않습니다.

DNA 샘플이 야생형 kogan grass에서 파생된 경우, Kogan grass specific primer set를 사용한 PCR 반응은 약 595개의 염기쌍에서 단일 밴드를 생성하는 반면 JBG 특정 primer는 밴드를 생성하지 않습니다. 마찬가지로, DNA 샘플이 JBG에서 파생되거나 되돌린 J-B-G-A-P-C-R 반응인 경우 JBG 특정 프라이머 세트를 사용하면 약 594개의 염기쌍에서 단일 밴드가 생성됩니다. Kogan 잔디 특정 프라이머는 밴드가 발생하지 않습니다.

JBG와 되돌린 JBG는 동일한 핵산 서열을 갖기 때문에 동일한 밴딩 패턴을 갖게 됩니다. 그러나 JBG와 JBG 되돌리기의 형태학적 차이는 매우 명백하므로 PCR 결과는 동일하지만 JBG 품종은 식물 수준에서 쉽게 구별할 수 있습니다. PCR 산물의 DNA 염기서열분석은 다양한 코간그래스 생태형에 대한 DNA 염기서열에서 가능한 변화를 식별할 수 있습니다.

이 기술의 개발은 야생형 K형과 풀, 그리고 관상용 품종인 일본 블러드 그래스의 되돌린 형태를 정확하게 구별할 수 있는 최초의 단순화된 분자 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 사용자는 이 프로토콜의 사용으로 파생된 결과를 보고하기 위해 당사에 연락할 것을 권장합니다. 이러한 공유 정보는 일본 블러드 그래스의 분포에 대한 정보를 제공하는 데 도움이 될 것입니다.

이는 또한 USDA의 규제 기관이 매우 침습적인 Cogan 잔디 품종의 확산 및 잠재적인 교잡을 우회하는 데 필요할 수 있는 조치에 대해 정보에 입각한 결정을 내리는 데 도움이 될 것입니다.