Name: 의 야생 - 타입과 장식 품종을 구별하기 PCR 기반 Genotyping 방법 Imperata cylindrica /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: 학습하세요 Imperata cylindrica의 침입종과 관상용 품종을 구별하는 PCR 기반 분자 유전자형 분석 방법을. 엽록체 trnL-F 영역 표적 특이적 프라이머를 사용하여 형태학적으로 구분 불가능한 품종을 신속하고 정확하게 식별합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 표본을 얻기에 도움 앨런 Tasker (USDA-진딧물, Riverdale, MD), 스티븐 콤튼 (클렘슨), 셰리 Aultman (클렘슨), 크레이그 램지 (USDA-진딧물, 포트 콜린스, 콜로라도), 그리고 베티 Marose (UMD)를 감사 . 우리는 비디오의 촬영에 그의 작업에 대한 학생 앤드류 아드리안 (UA-헌츠빌)와 데릭 대커 (UA-헌츠빌)이 프로토콜을 테스트하고 그들의 도움, 그리고 요셉 Herdy 감사드립니다. 이 작품은 국립 수산 및 야생 동물 재단에 의해 후원되었다.

<ol><li>Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. A Geographical Atlas of World Weeds. , Krieger Publishing Company. Malabar, Florida, U.S. (1979).</li>
<li>CABI, Crop Protection Compendium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCABI%2C++%22Commonwealth+Agricultural+Bureau+International+%28CABI%29%22">Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI)</a>. , Wallingford, UK. (2007).</li>
<li>MacDonald, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+-+Biology%2C+ecology%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).</li>
<li>Talley, S. M., Cseke, L. J. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalley%2C+SM+%22CPHST+Fort+Collins+Laboratory+2009+Annual+Report%22">CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report</a>. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 27-28 (2009).</li>
<li>Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogongrass+in+the+United+States%3A+History%2C+ecology%2C+impacts%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management.</a> Weed Technology. 12, 737-743 (1998).</li>
<li>Chikoye, D., Ekeleme, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weed+flora+and+soil+seedbanks+in+fields+dominated+by+Imperata+cylindrica+in+the+moist+savannah+of+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa.</a> Weed Research. 41, 475-490 (2001).</li>
<li>Weber, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeber%2C+E+%22Invasive+Plant+Species+of+the+World%3A+A+Reference+Guide+to+Environmental+Weeds%22">Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds</a>. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2003).</li>
<li>Patterson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shading+effects+on+growth+and+partitioning+of+plant+biomass+in+Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+from+shaded+and+exposed+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats.</a> Weed Science. 28, 735-740 (1980).</li>
<li>Cole, J. T., Cole, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamental+grass+growth+response+to+three+shade+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Horticulture%22%5BJournal%5D)">Ornamental grass growth response to three shade intensities.</a> Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).</li>
<li>Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+exposure+period+to+heat+on+cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability.</a> Weed Technology. 21, 141-144 (2007).</li>
<li>Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+Dynamics+and+Genotypic+Diversity+of+Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+at+the+Point+of+Introduction+in+the+Southeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Invasive+Plant+Science+and+Management%22%5BJournal%5D)">Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States.</a> Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).</li>
<li>Talley, S. M., Ramsey, C. L. Experimentally assessing the invasive potential of plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalley%2C+SM+%22CPHST+Laboratory+2009+Annual+Report%22">CPHST Laboratory 2009 Annual Report</a>. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 29-30 (2009).</li>
<li>Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetics+of+Miscanthus%2C+Saccharum+and+related+genera+%28Saccharinae%2C+Andropogoneae%2C+Poaceae%29+based+on+DNA+sequences+from+ITS+nuclear+ribosomal+DNA+and+plastid+trnLintron+and+trnL-F+intergenic+spacers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Res%22%5BJournal%5D)">Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers.</a> J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).</li>
<li>Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+DNA+barcodes+to+identify+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Use of DNA barcodes to identify flowering plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).</li>
<li>Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+relationships+in+southern+African+chloridoid+grasses+%28Poaceae%29+based+on+nuclear+and+chloroplast+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Systematics+and+Biodiversity%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data.</a> Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).</li>
<li>Brody, J. R., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+boric+acid%3A+a+Tris-free%2C+cooler+conductive+medium+for+DNA+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.</a> BioTechniques. 36, 214-216 (2004).</li>
<li>Chou, C. -H., Tsai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+intergenic+spacer+of+ribosomal+DNA+of+Imperata+cylindrica+%28L.%29+Beauv.+var.+major+%28Cogongrass%29+populations+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Bulletin+of+Academia+Sinica+%28Taipei%29%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan.</a> Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

<html> 미국의 보육 및 조경 산업은 이국적이고 새로운 식물 종을 재배하고 판매에 번성. 무역의 성장 세계화의 결합 이것은, 침입 식물 종 (种)을 입력 수립, 그리고 미국에서 연방 정부가 침략이 될 수있는 가능성을 포함하여 자주 사용할 수없는 정보에 의존 그러한 식물을 조절하는 능력을 확산 것이라는 가능성을 증가 , 토종과 귀화 taxa의 올바른 분류법, 그리고 유전 distinctness. 침입 식물이 우리의 지식은 종종 제한이기 때문에, 숨겨진 침입 특성과 수입 식물은 기꺼이 그들만이 우리 농업과 자연 자원을 침해하는 나중에 배우고 도입되었습니다. 이 프로토콜은 저와 관련된 이러한 문제를 해결하는 것을 목표로 정확하게 야생 형 cogongrass과 관상용 JBG의 대응의 복귀 형태를 구분할 수있는 최초의 단순 분자 방법을 제공하여 cylindrica 품종. 이 프로토콜의 개발을위한 jove_content &quot;&gt;은 야생 형 cogongrass은 2008 년 6 월 제이 플로리다 인근 산타 로사 카운티의 연못 크릭 임업 단위에서 귀화한 인구로부터 수집되었다. JBG는 상업 탁아소 (블루버드 보육, INC로부터 조달되었다 .. Riverdale, MA의 대학 공원 일부터 6 월 2009 년;) 6 월 2008 년뿐만 아니라 콜롬비아에서 주택 소유자의 컬렉션에서 미주리 JBG 준 2008 년 클렘슨 대학, 사우스 캐롤라이나에서 캠벨 지질 박물관의 안뜰에서 얻은 있었을갑니다 및 콜롬비아, 2009 년 미주리 (리랜드 Cseke 식별)의 주택 소유자의 정원에서. 모든 식물은 헌츠빌에서 알라바마의 대학 (헌츠빌, AL)에있는 온실에서 유지되었다. 이들 식물에서 수집한 DNA의 유전자 시퀀싱은 일반적으로 바코드 식물 2로 사용 9 독립적인 DNA 영역의 깊이 비교에 포함되어있었습니다. 모든 경우에서, JBG의 시퀀스를 따라서하는 데 도움 JBG 되돌릴 분들에게 100 % 일치했다JBG 실제로 녹색, 침입 형태로 되돌리려는 것을 확인합니다. 오직 핵 ITS와 엽록체 trnL-F 영역은 유전자 cogongrass와 JBG 구별하는 데 사용할 수있는 차이점이 있습니다. trnL-F 지역은 2 SNPs 2 InDels합니다 (삽입 및 삭제)이있는 동안은 ITS 지역, cogongrass와 JBG 사이 세 SNPs (단일 염기 polymorphisms)의 총 있습니다. 이러한 유전적 차이는 야생 형 cogongrass와 JBG이갑니다 구분 수있는 개발되는 다양한 특정 PCR의 primers를 허용했다. 가장 안정적인 결과는 plastid trnL-F 지역에서 파생된 primers에서 왔습니다. 따라서이 프로토콜은 cogongrass, JBG의 엽록체의 게놈의 trnL-F 지역 및 JBG (그림 4) 되돌 간의 순서의 차이에 따라 달라집니다. 문제의 종류, 더 구체적인 primers를 생성할 수 있도록하고 밀접하게 관련 종, 야외에서 잘못된 반응을 방지하기 위해I.의 리터 알려져 trnL-F 시퀀스 cylindrica 품종은 관련 잔디 종 (29 종 43 독립적인 시퀀스, 예를 들어, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-jobi, Miscanthus sinensis의, Saccharum officinarum, 수수 halepense)에서 trnL-F 시퀀스와 비교되었다. 우리는 잔디, 다양한 특정 primers의 특이성의 29 여종에 걸쳐 다양한 전용 프라이머 시퀀스를 검사 있지만 종합적으로 대부분의 다른 잔디 종에서 DNA를 증폭하는 기능에 대해 검사되지 않았습니다. 따라서 DNA 추출에 사용되는 조직은 신중하게 나로 식별되어야합니다 cylindrica 전에이 프로토콜을 시작합니다. 잔디는 다음 cogongrass 또는 JBG 중으로 확인할 수 없다면 우리는 시퀀스 cogongrass 또는 JBG에 정확히 일치하는 것을 확인하기 위해 PCR 제품을 시퀀싱하는 것이 좋습니다. 현재 주어진 잔디 시편의 신원을 확인하는 가장 정확한 방법은 t 모두에서 PCR을 수행하는 것입니다rnL-F와 ITS 지역 시퀀스 PCR 제품을 확인하고 정확하게 식별 taxa에서 알려진 시퀀스의 시퀀스를 비교하여 따라갔다. DNA가 컨트롤이 프로토콜에 설명된 primers (trnL-F 지역의 경우) 또는 다른 primers 기타 출판물 13-15에서 해당 이용할 수를 사용하여 증폭 할 수 있습니다. 시퀀싱이 훨씬 노동 및 간소화된 절차를 사용하여보다 집중적인 비용입니다. PCR에 사용된 primers의 품질은 프로 시저의 성공에 중요합니다. 우리는 경사 바이오 주식 회사 (에서 제공하는이 절차에 대한 primers를 만들었 <a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a> , 헌츠빌, AL). 경사 바이오에서 primers 주문에 대한 장점은 그들이 우리 실험실에서 최적화에 사용된 primers와 같은 동일한 샘플 생산 시리즈에서 각 프라이머의 aliquots 다수를 저장한다는 것입니다. 따라서, primers는 같은 순서를 가지고 있지만, t 없습니다야이 프로토콜에 사용되었습니다 동일한 생산 많이에서 왔어요. 같은 많은로부터 primers를 사용하여 PCR의 primers의 품질의 차이에서 발생할 수있는 절차에 필요없는 변수를 방지하는 데 도움이됩니다. 마찬가지로 다른 DNA 형성 촉매의 polymerases는 PCR, 사용된 DNA 형성 촉매 효소의 품질을 위해 좋을 동안 PCR 결과의 품질에 영향을 미칠 것이다. PCR 시약의 더 나은 일관성을 허용하기 위해, 우리는 Clontech의 시약을 사용하여 프로토콜을 최적화했습니다. 장점이 효소는 (Clontech, 캘리포니아 주 마운틴 뷰, 고양이 # 639201 또는 639202) 강력한, 핫 스타트 DNA 형성 촉매의 중합 효소의 혼합물과 높은 특이성과보다 정확한 amplifications를 제공하는 데 도움이 증명 독서 효소이다. 이 프로토콜은 maternally 목초에서 상속되는 엽록체의 DNA에 의존하기 때문에 cogongrass 및 JBG의 genotypes 사이의 하이브리드화 이벤트는 우리의 분자 식별 절차에 캡처되지 않을 수 있습니다. hypridization가 suspe는 경우cted, 우리는 양쪽 부모로부터 상속됩니다 핵 영역을 사용하는 것이 좋습니다. 식물 genotyping에서 고려해야 할 가장 일반적으로 사용되는 비 plastid 변수 영역은 핵 ribosomal ITS 지역 13-15,17입니다. 현재, 우리는 동일한 PCR 튜브에 핵 ITS 영역의와 엽록체 trnL-F 영역의 증폭을 멀티플렉싱으로 진전된다. 핵 DNA 영역으로 plastid 멀티플렉싱하는 것은 잠재적으로 홀로 중 하나를 사용하는 한계를 우회할 것이다 있지만, 이러한 방법은 케이스별로 사건에 타당성을 결정하는 최적화 및 추가적인 평가가 필요합니다. 정량 실시간 PCR (qPCR)과 같은 분자 비콘 (형광 프라이머 프로브) 등 최신 기술의 사용은 또한 고장 안전하고 정확한 식물 genotyping 방법으로 취급되고있다. 여기에 제시된 프로토콜은 JBG는 야생 형 cogongrass의에서 되돌릴 구별하는 빠르고 안정적​​인 접근 방식을 제공합니다. 우리는 사용 권장이 프로토콜의 RS는이 프로토콜의 사용에서 파생된 결과를보고하기 위해 저희에게 연락하십시오. 이러한 공유 정보 JBG는 되돌려의 분포에 관한 정보를 제공하는 데 도움이됩니다. 이것은 USDA의 규제가 매우 침략적 cogongrass 품종의 보급과 잠재 하이브 리다이 제이션을 회피 할 수있는 행동에 객관적인 판단을 내릴 도움이 될 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DNeasy 식물 미니 키트 </td><td> Qiagen, 발렌시아, 캘리포니아 </td><td> 69,104 또는 69,106 </td><td> 양질의 DNA를 얻을 모든 평판 게놈 공장의 DNA 키트는 다음 절차에 대해 잘 동작한다. </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0578 </td><td> 앞으로 긍정적인 제어 입문서 </td></tr><tr><td> trnL (5 &#39;엑손)-C </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0579 </td><td> 긍정적인 컨트롤 프라이머를 역방향 </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0864 </td><td> 앞으로 야생 형 cogongrass의 프라이머 </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0865 </td><td> 개머리판야생 형 cogongrass의 프라이머 </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0866 </td><td> 앞으로 JBG와 프라이머를 되돌 JBG </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2 </td><td> 경사 바이오 주식 회사 </td><td> 3-0867 </td><td> JBG와 프라이머를 되돌 JBG를 바꾸게되면 </td></tr><tr><td> 장점 UltraPure PCR dNTP 믹스 </td><td> Clontech, 캘리포니아 주 마운틴 뷰 </td><td> 639,125 </td><td></td></tr><tr><td> 장점이 중합 효소 </td><td> Clontech, 캘리포니아 주 마운틴 뷰 </td><td> 639,201 또는 639,202 </td><td> 좋은 증거 독서, 핫 스타트 DNA 형성 촉매의 중합 효소 </td></tr></tbody></table>

의 야생 - 타입과 장식 품종을 구별하기 pcr 기반 genotyping 방법 imperata cylindrica</em

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

야생 형 저 cylindrica (cogongrass)는 부정적인 아프리카, 아시아, 유럽, 뉴질랜드, 오세아니아 및 미주 1-2에 걸쳐 73 개국에서 농업과 천연 자원에 영향을 미치는, 세계 10 대 최악의 침입 식물 중 하나입니다. Cogongrass는 토착 식물 종의 큰 다양성을 치환하고 차례로 마초와 쉼터를위한 전이 원시 식물 수종에 따라 야생 동물을 위협 빠르게 - 확산, monodominant 스탠드를 형성합니다. 문제를 추가하려면, 관상용 다양한 [나 cylindrica VAR. koenigii (Retzius가)] 널리 Imperata cylindrica &#39;Rubra&#39;, 레드 바론, 일본 혈액 풀 (JBG)의 이름하에 판매됩니다. 이것은 다양한 putatively 살균 및 비침 투이며 붉은 단풍을위한 바람직한 관상용으로 간주됩니다. 그러나, 정확한 조건 하에서, JBG가 가능한 종자를 생산할 수있다 (캐롤 Holko 2009 개인 통신)와 나는 녹색으로 되돌릴 수 있습니다그것이 야생 형 침략 다양한 4 (그림 1)의 구분되는 특징에 걸릴 cogongrass에서 종종 구별할 수있다 nvasive 형식입니다. 이것은 신분도 잘받은 식물 taxonomists 위해 형태학 어려운 작업을 사용하여 만듭니다. 공격적인 녹색 표현형에 JBG의 복귀도 드문 아닙니다. 코딩 및 원자력과 엽록체 둘 다 DNA의 변수 영역의 시퀀스 비교를 사용하여, 우리는 JBG는 메릴랜드, 사우스 캐롤라이나, 그리고 미주리 주에서 내에 녹색 침략으로 되돌 것으로 확인되었습니다. 활성 cogongrass의 침입이 아닌 곳에 JBG는 대륙 미국에서 거의 모든 국가에서 판매하고 심은되었습니다. 잘 이해되지에서는 되돌릴 문제의 범위는 되돌 식물 문서화하고 종종 파괴 때문이다. 이 분자 프로토콜의 응용 JBG가갑니다 식별할 수있는 방법을 제공하고 공동 발생이 품종을 유지하는 데 도움ND 가능성이 hybridizing. Cogongrass가 다른 유전자형으로 건널 때 고맙게 여기게 outcrosser이며, - 바람의 분산 가능한 생산 5-7 넓은 거리를 통해 cogongrass 뿌리 씨앗을하실 수 있습니다. JBG는 cogongrass보다 약간 다른 유전자형을 가지고 있으며, cogongrass으로 가능한 하이브리드를 구성할 수 있습니다. 문제를 추가하려면, JBG는 cogongrass 8-10보다 추위와 관용 그늘이고,이 두 품종 간의 유전자 흐름은 더 공격적이다 하이브리드를 생성할 가능성이 야생 형 cogongrass보다 성의 관용, 그리고 차가운 그늘. 야생 형 cogongrass 현재 동남 미국에서 전세계 100 만 490여 헥타르, 감염 시켰어 있지만 그것은 500,000헥타르 통해 감염 시켰어하고 빠르게 북쪽의 광범위한 틈새 시장 및 지리적 잠재 3,7,11에 의한 확산으로 미국의 대부분을 차지하는이 가능합니다. 유전자 건널목의 잠재력은 USDA-진딧물 연방 유해 주 프로그램에 대한 심각한 우려입니다. 현재 USDA-진딧물은 주와 무에서 JBG 금지오히려 주요 cogongrass의 infestations (예, 플로리다, 알라바마, 미시시피)가 있습니다. cogongrass와 JBG 자신의 배포판을 확장할 그러나 결합에서 두 품종을 방지하는 것은 더 어려울 수 있습니다. 또한, JBG 되돌릴 수의 배포는 현재 알려지지 조직 형태를 통해 이러한 품종을 식별하는 능력없이 일부 cogongrass의 infestations은 JBG는 되돌려의 결과가 될 수도 있습니다. 불행히도, 신분의 현재 분자 방법은 일반적으로 소모 및 비용 시간은 둘 다 AFLP (증폭 단편 길이 Polymorphisms)와 DNA 시퀀싱에 의존하고 있습니다. 여기서는 정확 cogongrass와 JBG 되돌릴 구별하는 최초의 비용 절감 효과 및 안정적인 PCR 기반의 분자 genotyping 방법을 제시한다.

우리는 엽록체 trnL-F 스페이서 지역 내의 대상의 DNA 서열 차이의 종류를 구분하는 것이 다양한 특정 PCR primers의 직원을 고용하고 비용 효과적이고 신속한 분자 genotyping 프로토콜을 제공<em&gt; Imperata cylindrica</em&gt; (cogongrass) 혼자 형태로 구분할 수없는. 이러한 종류의 연방 목록에 유해 잡초, cogongrass과 밀접하게 관련, 넓은 확산 장식 다양성, 내가 포함<em&gt;. cylindrica</em&gt; VAR.<em&gt; koenigii</em&gt; (일본어 혈액 풀).

의 야생 - 타입과 장식 품종을 구별하기 PCR 기반 Genotyping 방법 Imperata cylindrica</em

야생형 I. cylindrica(코고니그라스)는 세계 10대 최악의 침입 식물 중 하나로, ...의 농업 및 천연자원에 부정적인 영향을 미칩니다.

본 절차의 주된 목적은 형태학적 특징만으로는 구별할 수 없는 gon grass라고 불리는 Retta cylindrica의 품종들을 구분할 수 있는 비용 효율적이고 신속한 분자 유전형 분석 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 관심 대상인 gon grass 품종의 조직을 식별하고 분리함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 수집된 조직에서 핵 DNA와 플라스티드 DNA를 추출하는 것입니다.다음으로, PLAs turn LF 영역의 서열 차이를 표적으로 하는 품종 특이적 프라이머와 적절한 양성 및 음성 대조군을 사용하여 추출된 DNA에 대해 중합효소 연쇄 반응을 수행합니다. 마지막 단계는 4가지 PCR 반응 각각에 대해 젤 전기영동을 수행하여 증폭된 PCR 생성물을 시각화하는 것입니다. 최종적으로, 젤에 나타난 품종 특이적 PCR 생성물 밴드 분석을 통해 수집된 곤그라스의 품종을 결정합니다. 외래 침입 식물은 미국에 연간 약 34억 달러의 비용을 발생시키며, 농업 및 천연자원 모두에 상당한 피해를 줍니다.Cogan grass로도 알려진 야생형 Imperata cylindrica는 세계 10대 최악의 침입성 잡초 중 하나입니다. Cogan grass는 토착 식생을 대체하는 단일 군락을 형성하여 빠르게 확산하며, 결과적으로 해당 토착 식생에 의존하는 동물들에게 영향을 미칩니다. 현재 이 잡초는 전 세계적으로 4억 9천만 헥타르, 미국 내에서는 약 50만 헥타르에 걸쳐 분포하고 있습니다. 또한, Imperata cylindrica의 관상용 품종은 Imperata cylindrica, Arbra, red Baren, 그리고 Japanese blood grass(이하 JBG로 지칭)라는 이름으로 널리 판매되고 있습니다. 이 품종은 추정상 불임이며 침입성이 없는 것으로 알려져 있으며, 붉은색 잎으로 인해 가치가 높다고 여겨집니다.특정 조건 하에서, 일본혈초(Japanese blood grass)는 생존 가능한 종자를 생성할 수 있으며, 야생형 코간그라스(cogan grass)와 구별할 수 없는 전체 녹색 형태로 회귀할 수 있습니다. 보시는 바와 같이, 두 형태 모두 녹색 잎을 가지고 있으며, 전통적인 관상용 품종보다 잎이 더 크고 크기도 더 큽니다. 또한, 회귀형 및 야생형 식물은 근경이 더 크며, 이는 관상용 품종의 무성 생식 잠재력을 증가시킵니다.형질 환원으로 인해 형태학만으로는 식별이 어렵습니다. 이는 매우 까다로운 작업입니다. 분자 생물학적 방법은 일반적인 시각적 수단으로는 식별할 수 없는 침입 식물 및 식물 재료를 정확하게 구별할 수 있는 수단을 제공합니다.분자 생물학적 방법은 외래 침입 식물의 확산과 유입을 방지하는 데 매우 중요합니다. 본 분자 프로토콜을 적용하면 일본혈초(Japanese blood grass)의 회귀 변이체와 코간그라스(Kogan grass)를 정확하게 구별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 코간그라스와의 공존 및 생존 가능한 잡종의 형성 가능성을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.증폭 단편 길이 다형성(amplified fragment length polymorphism) 또는 AFLP 분석, DNA 시퀀싱과 같은 기존 기술과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 야생형 kogan grass와 Japanese blood grass의 여러 품종 간의 차이를 쉽게 구별할 수 있는 매우 비용 효율적이고 신속한 분자 유전형 분석 기술을 제공한다는 점입니다. 이 기술의 시연은 저희 실험실의 학부생인 Joseph Hery가 맡겠습니다. 먼저 kogan grass 또는 Japanese blood grass가 자라고 있어 서로 구별이 필요한 지역에서 표본을 확인하십시오.일본혈초(Japanese blood grass)는 밝은 빨간색 잎으로 인해 야생형 코간초(Kogan grass)와 쉽게 구별됩니다. 그러나 일본혈초의 회귀변이체(revert)는 관상용 일본혈초보다 잎이 더 길고 초록색이며, 엽면적이 더 넓고 근경이 더 크기 때문에 코간초와 거의 구별되지 않습니다. 이 방법은 신선한 상태, 냉동 상태 및 최근에 건조된 잎 조직에 모두 적용할 수 있습니다.나중에 DNA 추출을 위해 조직을 보관해야 하는 경우, 가장 좋은 방법은 조직을 즉시 -80°C에서 냉동 보관하는 것입니다. 건식 보관이 필요한 경우에는 조직을 종이 봉투에 넣고, 해당 봉투를 실온에서 탈수된 실리카겔 또는 다른 활성 건조제와 함께 보관하십시오. 신선한 조직을 사용하는 경우, 분해를 방지하기 위해 수집 후 3시간 이내에 DNA를 추출하시기 바랍니다.본 절차는 제조사의 지침에 따라 Kyogen의 DNEZ plants mini kit를 사용하며, 한 가지 사소한 수정 사항이 있습니다. 여기에서 본 절차는 100 mg 이상의 신선 또는 냉동 조직이나 20 mg 이상의 건조 조직을 사용하도록 조정되었습니다. 먼저 냉각된 막자사발을 사용하여 액체 질소를 세 차례 투입하며 100 mg 이상의 신선 또는 냉동 잎 조직, 또는 20 mg 이상의 건조 잎 조직을 미세한 분말로 갈아줍니다.신선하거나 냉동된 조직에서 얻은 냉동 분말을 100 mg씩 분주하여 무게를 잽니다. 건조 잎 조직을 사용하는 경우에는 분말을 20 mg씩 분주하여 무게를 잽니다. 이 단계 이후, 제조사의 지침에 따라 DNA 추출을 진행하며 NanoDrop 분광광도계와 같은 분광광도계를 사용하여 DNA의 품질과 양을 테스트합니다. 양질의 DNA 수율은 µL당 50~150 ng 사이여야 하며, 260/280 및 230/280 비율은 여기에서 보이는 것과 같이 2.0에 가까워야 합니다.표준 1% AROS 겔을 사용하여 전기영동을 수행합니다. 10 KB보다 큰 상대적으로 큰 밴드들이 존재하는지 확인하십시오. DNA 농도가 높을 경우 RNA 오염으로 인한 스트리킹(streaking)이 거의 없거나 전혀 없어야 하며, 이후 단계를 위해 시료를 70 nanograms per microliter로 희석하십시오. 빨간색과 초록색 화살표로 표시된 본 프로토콜의 PCR 프라이머는 Cogan grass와 Japanese blood grass 유전자형의 plastered turn LF 스페이서 영역 간의 서열 차이를 기반으로 합니다.이러한 차이는 수직 검은색 화살표로 표시된 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms)과 삽입 및 결실의 형태로 나타나며, 이를 통해 품종 특이적 프라이머를 개발할 수 있습니다. 프라이머를 고유 서열 부위에 배치함으로써, 프라이머 서열은 프로토콜의 서면 부분에 포함되어 있습니다. 각 분리된 DNA 샘플에 대해 서면 프로토콜에 따라 각 프라이머 세트를 사용하여 0.2 milliliter 박벽 PCR 튜브에 50 microliter PCR 반응액 2개를 얼음 위에서 준비합니다. DNA 농도가 낮은 경우, 전체 반응 부피가 50 microliter로 유지되도록 핵산 분해 효소가 제거된 이중 증류수의 양을 조절하면서 각 반응에 DNA를 더 추가할 수 있습니다.DNA 샘플에 포함된 불순물이 PCR 반응을 억제할 수 있으므로, 반응당 DNA 사용량은 5 µL 또는 전체 부피의 10%를 초과하지 않도록 합니다. 모든 PCR 시약이 정상적으로 작동하는지 확인하기 위해 양성 대조군(positive control)을 설정하십시오. 양성 대조군과 동일한 프라이머 세트를 사용하되, 추출된 DNA 대신 2중 증류수를 넣어 음성 대조군(negative control)을 설정합니다. 이 시점에서 각 테스트 샘플당 총 4개의 PCR 반응이 구성됩니다. 다음으로, 가열 뚜껑이 장착된 서모사이클러(thermocycler)를 사용하여 서면 프로토콜에 명시된 PCR 사이클 매개변수에 따라 PCR 증폭을 수행하십시오. DNA, 프라이머, Taq polymerase의 품질이나 사용된 서모사이클러의 종류에 따라 프라이머 어닐링 온도, 신장 시간 및 사이클 횟수에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.PCR 반응이 완료되면, 표준 전기영동법을 사용하여 1% 겔에서 PCR 생성물을 분리하십시오. DNA 전선이 겔 전체 길이의 4분의 3 지점에 도달할 때까지 약 120V에서 샘플을 전기영동합니다. UV 광원 아래에서 겔을 시각화하고, 생성된 밴드를 검사하여 적절한 DNA 단편이 증폭되었는지 확인하십시오.이 대표 젤 이미지는 Kogan grass, Japanese blood grass, 그리고 Japanese blood grass revert DNA 샘플을 Kogan grass 및 JBG 특이적 프라이머와 결합하여 PCR을 수행한 결과와 turn LF 양성 대조군 및 템플릿 미첨가 음성 대조군의 전기영동 결과를 보여줍니다. turn LF 양성 대조군 프라이머 세트는 Cogan grass, Japanese blood grass, Japanese blood grass revert 및 기타 grass류에 대해 동일하게 잘 작동하며, 890 base pairs 크기의 밴드를 형성합니다. 모든 PCR 시약에 DNA 오염 물질이 없다면, 음성 대조군 반응에서는 PCR 산물이 생성되지 않습니다.DNA 샘플이 야생형 kogan grass에서 유래한 경우, Kogan grass 특이적 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응은 약 595 base pairs에서 단일 밴드를 형성하며, JBG 특이적 프라이머는 밴드를 형성하지 않습니다. 마찬가지로, DNA 샘플이 JBG 또는 복구된 J-B-G-A-P-C-R 반응에서 유래한 경우, JBG 특이적 프라이머 세트를 사용하면 약 594 base pairs에서 단일 밴드가 나타납니다. 반면 Kogan grass 특이적 프라이머는 밴드를 형성하지 않습니다.JBG와 회귀된 JBG는 핵산 서열이 동일하므로 밴딩 패턴 또한 동일하게 나타납니다. 하지만 JBG와 JBG 회귀체 사이의 형태학적 차이는 상당히 뚜렷하므로, PCR 결과는 동일하더라도 식물 수준에서 JBG 품종들을 쉽게 구분할 수 있습니다. PCR 생성물의 DNA 시퀀싱을 통해 서로 다른 코간 그라스 생태형의 DNA 서열 변화 가능성을 확인할 수 있습니다.본 기술의 개발은 야생형 K-grass와 그 관상용 품종인 Japanese blood grass의 회귀형을 정확하게 구별할 수 있는 최초의 간소화된 분자적 방법을 제공합니다. 본 프로토콜의 사용자들께서 해당 프로토콜을 통해 얻은 결과를 저희에게 알려주시기를 권장합니다. 이렇게 공유된 정보는 Japanese blood grass의 분포에 관한 정보를 제공하는 데 도움이 될 것입니다.이는 또한 USDA의 규제 당국이 침입성이 매우 강한 Cogan grass 품종의 확산 및 잠재적 잡종 형성을 방지하기 위해 필요한 조치에 대해 정보에 기반한 결정을 내리는 데 도움이 될 것입니다.

a-pcr-based-genotyping-method-to-distinguish-between-wild-type

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 조직에서 확인할 mRNA 레벨 및 침입 곤충의 종, 에메랄드 애쉬 송곳의 발달 단계에 qRT - PCR의 사용을 보여줍니다.

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

우리는 살모넬라균 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium의 급속한 탐지를위한 멀티 플렉스 PCR을 설명합니다. 특정 살모넬라균의 serovars는 유전자와 주어진 serovar의 O - 항원 생합성 클러스터 및 flagellin 고유의 시퀀스로 PCR 다중을 대상으로 확인할 수 있습니다. Serovar는 대상 allele에 해당하는 특정 크기 amplicons (PCR 제품)의 모양에 따라 분리 살모넬라균에 다음 할당됩니다.

확인을 위해 Allelotyping PCR 살모넬라 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium

여기에 제시된 직접 PCR의 접근 방식은 직접 unpurified 식물과 동물 조직의 작은 양의 PCR 증폭을 용이하게한다.

이전 DNA의 정제없이 식물과 동물 샘플의 Genotyping

여기, 선물이 RNA 샘플에 게놈 DNA (gDNA) 오염 추적에 대 한 프로토콜. 제시 방법 뇌관 특정 ribosomal DNA (rDNA) 유전자의 내부 베낀된 공백 지역 (ITS)을 활용합니다. 메서드는 대부분의 진핵생물과 원핵생물에서 DNA 오염의 안정적이 고 민감한 검출에 적합 합니다.

Ribosomal DNA에 따라 RNA 샘플에서 DNA 오염 평가

이 문서에서는, 우리는 고분해능 용융 분석 (HRM) 기지를 둔 표적 유도한 게놈에 있는 국소 병변으로 기술되는 프로토콜을 제시합니다 (TILLING). 이 방법은 DNA 이중의 용융 동안 형광 변화를 이용하고 삽입 / 삭제 (Indel) 및 단일 염기 서브 스티션 (SBS)의 높은 처리량 스크리닝에 적합합니다.

쌀의 경작 인구에서 고분해능 용융에 의한 돌연변이 식별

PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별과 형광 현미경 검사법에 의한 자기(in)호환성을 결합한살구(Prunus armeniaca L.) 품종의 수분 요건을 확립하는 방법론을 제시한다.

손 수분, 현미경 검사법 및 유전자 분석을 결합한 살구의 자기 및 간 호환성 관계 결정

여기에 휴대용 qPCR 시스템을 사용하여 Matricaria chamomilla의 현장 식별을위한 프로토콜이 여기에 제시된다. 이 수행하기 쉬운 프로토콜은 농장이나 창고와 같이 실험실 장비 및 전문 지식에 대한 액세스가 제한된 위치에서 식물 종의 신원을 확인하는 방법으로 이상적입니다.

휴대용 qPCR 시스템을 이용한 마이트리카리아 샤모말라의 현장 식별

일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있는데, 이는 형광 현미경검사법에 따른 꽃가루 관의 현장 및 실험실 오염물질 및 관찰과 PCR에 의한 S-유전자형 식별 및 수분제 선택을 위한 꽃의 모니터링을 결합한 것입니다.

현상학 모니터링, 손 오염, 형광 현미경 검사법 및 분자 지노티핑에 의한 일본 매화의 수분 요구 사항 수립

이 프로토콜은 자아 Caenorhabditis 선충류의 대규모 생태 조사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 자연에서 수집 된 선충류와 관련된 생태 및 분자 데이터의 효율적인 조직 및 분석입니다.

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

이 프로토콜은 감귤류 품종의 꽃가루 호환성과 비호환성을 결정하는 빠른 방법을 제공합니다.

수동 수분, 현미경 및 S-유전자형 분석을 사용한 감귤류의 자체 (in)호환성 및 inter-(in)compatibility 관계 결정

학습하세요 Imperata cylindrica의 침입종과 관상용 품종을 구별하는 PCR 기반 분자 유전자형 분석 방법을. 엽록체 trnL-F 영역 표적 특이적 프라이머를 사용하여 형태학적으로 구분 불가능한 품종을 신속하고 정확하게 식별합니다.

의 야생 - 타입과 장식 품종을 구별하기 PCR 기반 Genotyping 방법 Imperata cylindrica

더 많은 동영상 탐색